contrôle interne en RTqPCR

[invite6bdf95b8]

Bonjour,

Je dois rendre un rapport concernant une étude portant sur la détection du virus de la FCO (en médecine vétérinaire). Pour cela, on utilise deux RT-q-PCR en parallèle, chacune spécifique d'un segment d'ARN (le virus est un virus à ARN). Mais on utilise également une RTqPCR pour la détection de la béta actine en tant que contrôle interne, et ceci dans des échantillons négatifs ou positifs pour le virus...

Quelqu'un pourrait-il m'expliquer le principe de contrôle interne, car mon professeur n'a pas été très clair sur ce point, il a évoqué le fait que cela permettait de gommer les variations entre les différents échantillons car l'on se rapportait à un même gène exprimé de façon basale...

Merci beaucoup pour votre réponse !

Charlotte
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[invite853321bf]

Le problème d'une PCR en général est qu'elle peut être inhibé de toutes sortes de façon et par beaucoup de molécules présentes dans l'environnement. De plus, l'ARN est une molécule assez fragile et les RNases sont des protéines pratiquement impossible à inhiber complètement.
Pour ces raisons (et quelques autres), on utilise un témoin interne, c'est à dire on amplifie un ARN qui se trouve normalement à concentration "constante" dans notre échantillon (du moins tout le temps exprimé à un niveau détectable). Ca en fait ainsi un témoin positif à l'intérieur même du puits. Si il y a amplification du témoin interne, on a bien extrait de l'ARN non lysée de notre échantilon et la PCR n'est pas inhibée , donc un résultat négatif indique bien que l'échantillon ne contient pas ton ARN cible (donc qu'il est bien négatif)

Il y a aussi une autre façon de le faire, c'est de rajouter l'ADN de notre contrôle interne dans notre mix PCR (ou l'ARN avant la RT dans ton cas) et de l'amplifier, cela permet d'être sur de son amplification (et de sa RT) mais pas de son extraction.

[Flyingbike]

cela peut aussi servir a normaliser une concentration d'intérêt si l'on part du principe que le contrôle interne a une expression constante.

Pour cela on peut utiliser l'actine, la cyclophiline, l'ARN 18S....

[invite6bdf95b8]

merci pour vos réponses !
je pensais effectivement plutôt à un contrôle interne servant à normaliser les résultats, et c'est plutôt cela que je ne comprends pas ... (car en fait le contrôle interne n'est ici pas réaliser en multiplex car il existe des interférences entre les différentes PCR, les PCR sont donc réalisées dans des tubes différents)

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite853321bf]

Dans ce cas, ça s'appelle plus un contrôle positif.

[invited9d41589]

Oui, dans le jargon on appele ca un gène de ménage ou de normalisation.
Le gène de normalisation est exprimé de facon constitutif dans le tissu et quelque soit le traitement, donc en théorie il ne doit pas varier. Si une variation est détecté sur ce gène, (mauvais dosage? influence du traitement?...etc) , cette variation devra être alors répercutée sur le gène cible en question.

Cordialement