Empreinte à la DNase+ TAMOXIFENE

[invitebd1c6e2a]

Bonjour,

j'ai vraiment besoin d'explications sur des techniques de Biomol, or je sais qu'içi vous en connaissez un rayon^^

Tout d'abord je ne suis pas totalement sure d'avoir compri comment on detecte une sequence ENHANCER ou SILENCER par la DNASE footing prints. Dapres mes notes les regions ENhancers ont beaucoup de Proteines regulatrices donc sont peu accessible a la DNASE, qui donc ne "coupe"pas cette sequence: ce serait pour ca qu'on verrait sur la Mbr un trou, enfin une absence de bande... Est ce que je me trompes?

Ensuite je ne comprend pas pourquoi quand on fait une construction inductive avec CRE LOX P on utilise le tamoxifene qui est un antioestrogene pour que CRE rentre dans le noyau?

Je ne pense pas être très claire mais étant donné que je ne comprends pas tout, je ne sais pas trop comment formuler mes questions...

MERCI une étudiante en manque d'explications^^
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[Edelweiss68]

Bonjour,

Pour la deuxième question, le tamoxifène ne sert pas à faire rentrer la CRE dans le noyau mais à induire l'expression de cette CRE soit de permettre son expression au moment voulu dans le temps.

Pour cela, le gène exprimant la CRE comporte également un site de liaison au tamoxifène. Ainsi, de faibles doses de tamoxifène vont induire l'expression de l'activité recombinase de la CRE.

[invitebd1c6e2a]

MERCI! en revanche je ne comprends toujours pas pourquoi le tamoxifene est un antioestrogene, je l'ai noté sur mon cours mais je ne vois pas l'intérêt...

[Edelweiss68]

Le tamoxifène est un antiestrogène car il inhibe la liaison de l'oestradiol à son récepteur en se liant de façon compétitive au RE (récepteur à l'oestradiol) sans pour autant déclencher d'action estrogénique.

Mais je ne sais pas pourquoi on utilise cette molécule et pas une autre avec un autre site de liaison et ça m'intéresserait bien de le savoir! Peut-être avait-on fait les premiers essais avec cette molécule et vu que ça marchait, on a pas changé? Ou pas?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite02e16773]

Bonjour,

Concernant l'empreinte à la DNAse 1.
Une seule extrémité d'un seul des deux brins d'ADN est marqué.
La DNAse coupe en moyenne une seule fois par fragment. Elle ne coupe pas là où une protéine est fixée.
Conséquence : dans des conditions "normales" (sans protéine), on obtient une multitude de bandes après migration sur gel.
Si on place une protéine dans le milieu avant digestion et que celle-ci se fixe sur une séquence d'ADN, on observera disparition de certaines bandes ; comme l'ADN n'est marqué qu'aux extrémités, on peut savoir grossièrement où la protéine s'est fixée.

Cette méthode permet de démontrer qu'une protéine X se fixe à une séquence approximative Y de l'ADN, mais ne permet pas de dire si Y est enhancer, silencer ou quoi que ce soit d'autre.

Pour détecter une séquence enhancer ou silencer d'un gène d'intérêt, il faut démontrer que la délétion ou la mutation de la séquence entraîne une modification de l'expression du gène régulé (ou du rapporteur ayant pris la place du gène).

[Flyingbike]

par rapport a la cre inductible par le tamoxifène, il s'agit bien de déclencher la translocation nucléaire de la recombinase et non une induction de son expression.

la cre est fusionée avec le domaine de liaison du ligand du récepteur aux oestrogènes (DLL ER), domaine qui est artificiellement muté pour ne lier que des oestrogènes de synthèse (comme le tamoxifène).

Sans tamoxifène, la protéine de fusion cre-dllER est séquestrée dans le cytoplasme par des chaperonnes (HSP70). Lorsque l'on ajoute le tamoxifène, le DLL change de conformation, libère les chaperonnes et la protéine de fusion peut entrer dans le noyau et exciser la portion d'ADN comprise entre les séquences LoxP.

[Edelweiss68]

Ah d'accord, du coup désolée...

Mais un autre système inductible avec une autre molécule que le tamoxifène a-t-il déjà été utilisé?

[Flyingbike]

oui, il y en a plusieurs, notamment la tetracycline qu'on utilise dans le systeme tet-on/tet-off : http://en.wikipedia.org/wiki/Tetracy...nal_activation

[Edelweiss68]

OK, merci.

[piwi]

Petite explication du concept de mutation conditionnelle Cre/Lox inductible ici: http://www.futura-sciences.com/fr/ne...utantes_13390/

Cordialement,
piwi

[invitebd1c6e2a]

Merci beaucoup je suis agréablement surprise de vor qu'autant de personnes prennent le temps de répondre à mes interrogations! Mais mieux J'AI COMPRIS!