transfection lipofectamine LTX and PLUS reagent invitrogene

[invite4ff9937a]

Bonjour

Je vais faire une transfection avec le kit mentionné dans le titre.
Or j'ai un doute sur le protocole.

Il est dis dans ce protocole de mettre les cellules en culture 24h avant dans une plaques 24 puits avec 500µl de milieu

Le lendemain:1) Dilute the optimized amount of plasmid DNA in 100µl Opti-MEM 1 reduced serum medium
2)Add the optimized volume of PLUS reagent directly to the diluted DNA
3) add the optimized volume of LTX lipofectamine to the diluted DNA and incubate 30 min at room temperature.
4) add 100µl DNA-lipid complexe (step3) dropwise to the well containing cells. Incubate until 6h max.


Ma question est dois-je ajouter les 100µl dans le milieu de culture de la veille (qui contient de l'antibio! Bon a la limite je le change avant et j'en mets sans ATB) ou est-ce que implicitement le fait qu'il y 'est du milieu Opti-MEM je dois comprendre que je dois enlever le milieu de culture et que le milieu Opti-MEM fait office de milieu de culture pendant les 6 h d'incubation?

Voila si quelqu'un à déjà utilisé ce quitte ou est un habitué des transfections.

cdt
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[LXR]

En effet, avant le dépôt de ta solution de transfection sur tes cellules, enlève le milieu de culture et lave les cellules au PBS (moi je lave deux fois pour être sûr de bien éliminer le sérum présent dans le milieu de culture).

[invite4ff9937a]

Merci LXR, je te fais confiance

[invite12cad8f0]

Bonjour descmarc

D’abord je réponds à ta remarque sur les antibios.
Je ne connais pas bien la lipofectamine LTX, mais j'ai manipulé beaucoup d'autres agents de transfection synthétiques ces derniers temps (dont la lipofectamine 2000), et ils fonctionnent tous plus ou moins de la même manière, et ont une structure moléculaire similaire.
Ces molécules sont composées d’une tête polaire (dérivé cholestérol, dérivé d’aminoglycoside…) qui interagit avec les charges négatives de ton acide nucléique et d’une queue hydrophobe (acide gras) qui va faciliter son interaction avec la membrane de tes cellules.
Dans le milieu Opti-MEM, ta lipo va former un liposome et y séquestrer ton acide nucléique. Au contact de la cellule, la membrane plasmique va fusionner avec ton liposome, puis créer un endosome par endocytose. Donc le contenu de ton liposome n’entre pas en contact avec le milieu.

Tout ça pour dire que la composition de ton milieu ne sera pas une condition limitante. La présence d’antibiotique dans ton milieu de culture pendant la transfection n’est pas gênante, et même si par habitude je transfecte toujours sans sérum, une transfection en présence de sérum fonctionne bien également. Cependant :
- Utilise du milieu opti-MEM sans antibio pour former tes complexes Ac. Nucl./lipo, surtout si tu transfectes des siRNA.
- Remets du sérum dans le milieu après 4 à 6h de transfection si tu transfectes sans.

Ensuite, pour répondre à ta question principale :
Pour 100µL de milieu de transfection (ADN-lipo-Plus reagent dans de l’opti-MEM), je te conseille d’ensemencer tes cellules la veille dans 1mL de milieu (si tu cultives en plaques 24 puits, à adapter sinon) de manière à ce qu’elles soient à ≈80% de confluence le lendemain, puis le lendemain pendant l’incubation de tes complexes, de laver ton puits avec du PBS, de remettre 400µL de milieu de culture sans serum puis d’y rajouter tes 100µL de milieu de transfection (limiter le volume pendant la transfection permet de réduire le temps que mettront les liposomes pour sédimenter). 4h plus tard, change le milieu, ou bien rajoute 55µL de sérum (10% final) et laisse en culture jusqu’au lendemain (voire plus).
Autre possiblité : au lieu de mettre 400µL de milieu sans serum, rajoute 400µL de milieu opti-MEM (avec ou sans ATB) dans tes 100µL de milieu de transfection et dépose délicatement les 500µL sur tes cellules (et remet du milieu classique après 4h)

Désolé de m’être autant étendu . J’espère au moins que j’ai répondu à ta question .

Sans indiscrétion : Quel type cellulaire veux-tu transfecter ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[Nelwynn]

bonjour

je n'ai pas trouvé de discussion récente plus proche de mon soucis que celle ci donc je squatte

je tente qepuis quelques temps déjà d'améliorer mon taux de transfection qui frôle le néant. je tente de transfecter un plasmide contenant CFP fusionnée au gène CREBBP (11 kb le total) et un plasmide contenant YFP fusionnée au gène TDG (7-8 kb le total) dans des Cos-7.
le thésard qui a commencé ces manip le faisait avec du FugeneHD mais personnellement après plusieurs tests je n'obtiens pas un taux de transfection extraordianire pour CREBBP-CFP.
j'ai donc tenté avec de la lipofectamine2000 et là j'ai une grosse mort cellulaire même si je change le milieu 4h après transfection.
je cultive mes cos-7 dans du DMEM @ 2.5% de sérum car je vais ensuite les traiter avec de l'acide rétinoique pour certaines conditions et mon chef m'a donc demandé de limiter le biais du au sérum.
en temps normal elles n'ont pas de soucis avec ça.
je ne comprend pas pourquoi j'ai autant de mort cellulaire?

merci à l'avance à celui/celle/ceux qui me répondront

[invite12cad8f0]

Bonjour Nelwynn

Avant tout, une question peut-être bête mais je ne connais pas bien les gènes que tu étudies : Ta mort cellulaire n'est-elle pas justement dûe à la surexpression des protéines que tu veux étudier ?


Pour la transfection en elle-même, les lipides cationiques restent relativement toxiques pour les cellules, et les fournisseurs de réactifs de transfection sont bien souvent vagues, là où certains n'en parlent même pas , sur la notion d'optimisation de la quantité de Lipofectamine et d'ADN à utiliser lors des transfections.

Le rapport entre les charges positives de ton lipide cationique et les charges négatives de ton ADN est très important, et le rapport optimal est fonction de ton type cellulaire.

Pour optimiser ta transfection, essaie de faire varier ta quantité de Lipo (par exemple 1µL, 2µL et 4µL par puits de plaque 24 puits) et ta quantité d'ADN (250ng, 500ng, 1000ng). Si tu as les meilleurs résultats pour 1µL de lipo, essaie avec 0.5µL etc...
Si possible, essaie de faire cette optimisation avec des plasmides ne codant que pour le fluorophore (sans ta protéine d’intérêt), si tu en as, et vois par la suite avec tes plasmides d’intérêt si tu retrouves le même taux de transfection.

Pour la question du sérum, tu peux transfecter tes cellules avec seulement du milieu Opti-MEM. Il leur apportera les nutriments nécessaires pendant les 4h de transfection.

Tes Cos-7 sont à quel passage ? A quel pourcentage de confluence transfectes-tu (idéalement vers 80%) ?
Essaie aussi de parcourir la littérature pour voir comment d'autres équipes de recherche ont transfecté des Cos-7 avec de la lipo2000.

Cdlmt

[Nelwynn]

Merci poussin60 pour ta réponse.

je transfecte en Opti-MEM comme indiqué sur le protocole du fournisseur et dans les quantité prescrites par le fournisseur. j'ai déja essayé une gamme de lipo mais ayant oublié de changer le milieu au bout de 4h j'ai pensé que la mort cellulaire que j'obtenais venait de là. j'ai donc choisi de respecter à la lettre le protocole fourni.
je transfecte à 70-80% de confluence.

mes 2 protéines sont normalement pas dangereuses car l'une est une enzyme de réparation et l'autre un coactivateur transcriptionnel.

Pour la biblio je vais en effet creuser un peu.
et faire une gamme de transfection uniquement avec mon plasmide contenant le fluorophore; j'ai pas mal de stock ^^.

est ce que je dois les cultiver en Opti-MEM même après avoir changé le milieu de transfection selon toi?

merci encore d'avoir pris du temps pour me répondre

[invite12cad8f0]

Je n'ai pas beaucoup de recul sur la culture des cellules en Opti-MEM. Je n'utilise ce milieu que pour la phase de transfection proprement dite, par la suite je remets toujours le milieu de culture classique.
Mais cela peut faire l'objet d'une comparaison intéressante.

[invite1260514a]

Bonsoir,

Pour l'opti-MEM, il m'est arrivé très souvent de transfecter directement dans le milieux de culture sans passer par l'étape opti et pour certains types cellulaires ça marche mieux et je changeais le milieu pour éliminer les morts... Sinon si tu utilise de l'opti je conseille de changer le milieu de transfection genre le soir si tu fais ça très tôt le matin car les cellules n'aiment pas rester trop longtemps dans ce milieu surtout qu'elles ont déjà été très stressées par le lipofectant

[Nelwynn]

bonjour

merci à vous 2 pour vos réponse.
je pense que la lipo n'est pas une bonne solution pour mes cellules car hier j'ai tenté de sauver les quelques cellules tranfectées non mortes et ce matin que des cadavres dans la boite. par contre mes cellules transfectées avec au calcium phosphate sont ok donc je vais rester en calcium phosphate, moins cher en plus.

pour l'Opti-MEM j'ai découvert ça dans mon nouveau labo (mon équipe ayant déménagée récemment) et je n'avais jamais eu de soucis quand je l'utilisais avec du fugene.

j'espère que mon taux de transfection au calcium sera bon, résultats ce soir.

merci encore pour vos réponses