Bonjour à tous,
J'ai un petit problème dans une des mes expériences. Je produits des protéines dans des E. coli en corps d'inclusion. J'effectue un protocole de récupération de ces corps d'inclusion assez long mais efficace (pour l'avoir testé sur deux autres protéines)
Ce protocole consiste à disrupter les cellules puis à solubiliser les membranes dans du triton x-100 une nuit, puis solubiliser les corps d'inclusion dans de l'urée 8 M.
Je purifie ensuite mes protéines en les passant sur une colonne à nickel (mes protéines possèdent des queues polyhistidine), toutes les étapes jusqu'à l'élution se font en urée 8M.
J'effectue ensuite des étapes de renaturation.
Ce protocole a fonctionné pour 2 protéines mais pour la 3eme un problème survient dans la purification. La protéine se charge correctement sur la colonne (je n'ai presque rien qui ne s'accroche pas), elle résiste aux lavages et au moment de l'élution je me retrouve avec une bande beaucoup plus basse, comme si la protéine avait été tronquée ou digérée...
Ma question est la suivant : une protéine peut-elle se dégrader dans de l'urée 8M, les éventuelles protéases ne doivent pas être à leur aise, et pourquoi est-ce que je ne retrouve ça qu'à l'élution? Est-ce que l'imidazole peut cliver une protéine?
Merci d'avance de vos réponses
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