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Dégradation de protéines dans l'urée 8M



  1. #1
    Aqualung

    Dégradation de protéines dans l'urée 8M


    ------

    Bonjour à tous,

    J'ai un petit problème dans une des mes expériences. Je produits des protéines dans des E. coli en corps d'inclusion. J'effectue un protocole de récupération de ces corps d'inclusion assez long mais efficace (pour l'avoir testé sur deux autres protéines)

    Ce protocole consiste à disrupter les cellules puis à solubiliser les membranes dans du triton x-100 une nuit, puis solubiliser les corps d'inclusion dans de l'urée 8 M.
    Je purifie ensuite mes protéines en les passant sur une colonne à nickel (mes protéines possèdent des queues polyhistidine), toutes les étapes jusqu'à l'élution se font en urée 8M.

    J'effectue ensuite des étapes de renaturation.

    Ce protocole a fonctionné pour 2 protéines mais pour la 3eme un problème survient dans la purification. La protéine se charge correctement sur la colonne (je n'ai presque rien qui ne s'accroche pas), elle résiste aux lavages et au moment de l'élution je me retrouve avec une bande beaucoup plus basse, comme si la protéine avait été tronquée ou digérée...

    Ma question est la suivant : une protéine peut-elle se dégrader dans de l'urée 8M, les éventuelles protéases ne doivent pas être à leur aise, et pourquoi est-ce que je ne retrouve ça qu'à l'élution? Est-ce que l'imidazole peut cliver une protéine?

    Merci d'avance de vos réponses

    -----

  2. #2
    Flyingbike

    Re : Dégradation de protéines dans l'urée 8M

    t'es tu assuré que la protéine produite était la bonne ? (bonne taille)

  3. #3
    Aqualung

    Re : Dégradation de protéines dans l'urée 8M

    Oui, j'ai posé la charge de la colonne sur gel également, elle est à la bonne taille, c'est vraiment au moment de l'élution qu'il se passe quelque chose.

    J'ai vu sur un site quelqu'un expliquant que l'imidazole pouvait entrainer un semblant de dégradation sur gel, j'ai lancé une renaturation et dialyse pour éliminer l'imidazole, on verra ce que ça donne...

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