Passer par le double hybride ?

[invitee170a0e7]

Bonjour à tous,
depuis quelques temps je me heurte à un drôle de soucis

Je vais à la pêche d'une sous-unité (gamma) d'un complexe hétérotrimérique. Le hic, c'est qu'il n'y a rien dans les banques d'EST, et que chez d'autres espèces il n'y a pas de zones suffisamment concernés (3/4 a.a par ci par là). Cette sous-unité a déjà été trouvé chez d'autres modèles par double-hybride (en se servant de la sous-unité Beta comme hameçon) ou ils avaient déjà les séquences (génome séquencé).

Ma première approche a été de créer des amorces dégénérées, mais le résultat n'est pas concluant. Du coup je pense sérieusement à passer par le double hybride mais comme c'est une technique que je ne connais (en pratique) pas, ça me parait un peu "lourd" comme procédé.

Je voudrais savoir si vous connaissiez une alternative (ou plusieurs) ?


Merci beaucoup
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[piwi]

Bonjour,

Que voulez vous faire exactement? Simplement montrer que votre sous unité existe?

Cordialement,
piwi

[invitee170a0e7]

oui, dans un premier temps la trouver et la caractériser (localisation tissulaire/subcellulaire). Dans un second temps produire la protéine et voir si elle est impliquée dans certains mécanismes de mon modèle (ce dont on pense fortement).

Pas évident de travailler sur un organisme où il n'y a pas grand chose ^^ (~20 000 EST mais un paquet de redondance).

Merci pour votre réponse .

[piwi]

Le double hybride ne vous apportera strictement rien dans le premier temps de votre projet.
J'ai cru comprendre entre les lignes que le génome de votre organisme n'est pas séquencé. Je me trompe?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee170a0e7]

c'est exact. Et je ne pense pas qu'il le sera un jour
Enfin si, dès qu'on tombera à quelques milliers de dollars pour séquencer n'importe quelle organisme, alors là il y aura une petite chance...

Le double hybride me permettrai de récupérer la sous-unité gamma à l'aide de la béta (vu qu'il y a une forte intéraction entres-eux). Il me suffirait (?) alors de récupérer les clones positifs (normalement eux seuls auront poussés sur le milieu minimum), de vérifier par PCR (pour éliminer les faux-positifs) puis d'envoyer le plasmide au séquençage, non ?

[piwi]

Une technique un peu moins lourde si vous souhaitez juste prouver la présence de votre sous unité est de produire (bactérie ou bacculo) une version taguée de votre sous unité (genre GST-) et faire un GST pulldown contre un extrait protéique issu de votre modèle.
Si ça interagit fort vous devriez avoir une patate au niveau du PM de votre sous unité . Dans un second temps vous pouvez découper la bande et envoyer tout cela en mass spec histoire d'identifier la protéine et de la relier définitivement comme ce qu'elle est.
Ca parait lourd comme cela mais ca le sera sans doute moins qu'un double hybride. Le double hybride est vite expliqué dans la théorie mais est une manip très lourde dans la pratique, vous allez y passer un très long moment.

Cordialement,
piwi

[invitee170a0e7]

C'est qu'au labo on a une banque de cDNA ayant servi pour du simple hybride. On a pas à la créer (le côté "lourd" du double hybride ?). Le hic c'est qu'elle est précieuse (y'en plus beaucoup) et ne m'était pas du tout destiné

Je ne connaissais pas le GST pulldown. C'est un genre de co-immunoprécipitation dans le principe ?

En tout cas merci pour le conseil. Je vais explorer cette piste

[piwi]

Oui c'est cela.
Tu couples la GST à ta protéine d'intérêt et tu la fais s'exprimer. Ensuite tu utilises des billes sepharose-gluthation pour attraper la GST et donc ta protéine d'intérêt.
Une fois que les protéines sont sur les billes tu peux faire des rinçages plus ou moins drastiques et mettre tes billes sur un extrait protéique. Tu laisses interagir une nuit ou quelques heures et tu rinces dans des conditions de stringence saline plus ou moins forte. finalement tu élues avec du gluthation libre.

Pour le double hybride c'est pas si simple. Il faut que ta protéine d'intérêt s'exprime bien dans les cellules (levure ou bactérie, il faut parfois tester plusieurs conditions de culture). Il faut ensuite voir dans quelle mesure elle n'autoactive pas le système. Bref, c'est pas évident, y a pas mal de contrôles à faire.