Bonjour à tous,



Je me lance cette semaine dans des tests d'ubiquitylation sur des 293T transfectées. Et j'ai quelques petites questions associées... Est-ce que quelqu'un pourrait m'éclairer ?

- A quelle température doit être effectuée la lyse idéalement et durant combien de temps ? Habituellement, je lyse mes cellules à 4°C durant 5-30 min selon le temps dont je dispose. En est-il de même pour ce type de test ? Y a-t-il un timing bien précis ? J'ai peur qu'en laissant trop longtemps, les protéines ubiquitylées soient dégradées par le protéasome ou déubiquitinées.

- Mettez-vous du NEM ou un composé similaire dans votre tampon de lyse pour inhiber les déubiquitinases ? Est-ce réellement indispensable ou peut-on faire sans ?

- Enfin, petite question "existentielle" que je me pose souvent sans parvenir à trouver une réponse ferme et définitive... A quelle température est-il préférable de conserver les extraits protéiques ? D'une manière générale et plus particulièrement pour ces tests ?


J'ai parcouru pas mal la littérature et je ne trouve pas de réponse précise à ces questions. La plupart du temps, ces différents points ne sont pas précisés clairement dans les papiers (sauf pour le NEM, mais là, ça varie d'un article à l'autre ^^).

Merci d'avance !


Dizaall