Problème de PCR

[invite8a029766]

Bonjour,

Comme vous le remarquerez, je viens d'atterrir sur ce forum. EN effet, en cherchant sur internet une solution à mon problème, j'ai vu que y avait pas mal d'information ici! et j'espère que j y trouverai ma solution
Vous voilà ma situation:
On a fait amplifier de l'ADN de certains de nos échantillons et on faisant migrer les produits sur gel, il s'est avéré que y a eu contamination (révélation d'une bande sur gel correspondant au contrôle négatif).
Pour savoir quel est le réactif de la PCR qui est contaminé, on a procédé à refaire une autre PCR mais cette fois ci sans l'ADN de nos échantillons. (Je sais qu'il est plus pratique de jeter les anciens réactif suspects d'être contaminés et refaire le travail avec un tt nouveau kit!! Mais faute des moyens, on a voulu quand même garder certains de l'ancien Kit s'ils s'avèrent non contaminés, surtout la polymérase qui coûte de l'argent )
Alors, la nouvelle réaction de la PCR consiste à mettre dans les différents tubes que des nouveaux réactifs à part un qui soit ancien (utilisé pour ma première PCR). Et cela suivant le tableau ci après:

Buffer ________A N N N N N
Primer1_______N A N N N N
Primer2_______N N A N N N
dNTPs________N N N A N N
H2O______ ___N N N N A N
TAQ_______ __N N N N N A

Mon problème est que la migration des produit final de la PCR, a donné le résulta suivant:
Aucune bande qui pourrait montrer une certaine amplificationd'un fragment d'ADN! par contre tout en bas du gel et au niveau de tous les tubes y a une bande de la même taille et même intensité (paraît comme s'il s'agissait de fragments d'ADN dégénérés !!!) et qui correspond à la plus petite bande du marqueur et qui est située aussi tt en bas!!
Personnellement, et vu mes connaissance trèèès modestes ds ce domaine, je n y ai trouvé aucune explication à ce résultat!
avez vous une idée?
Merci d'avance
-----

[inviteb753ced1]

Aucune bande qui pourrait montrer une certaine amplificationd'un fragment d'ADN! par contre tout en bas du gel et au niveau de tous les tubes y a une bande de la même taille et même intensité (paraît comme s'il s'agissait de fragments d'ADN dégénérés !!!) et qui correspond à la plus petite bande du marqueur et qui est située aussi tt en bas!!

Hello

Il s'agit des dNTPs, (on parle de "smear" dans ce cas je pense).

[invite853321bf]

Mon problème est que la migration des produit final de la PCR, a donné le résulta suivant:
Aucune bande qui pourrait montrer une certaine amplificationd'un fragment d'ADN!

C'est à dire ? Tu n'as aucune amplification du tout, même pas celle attendue ?

[Flyingbike]

Hello

Il s'agit des dNTPs, (on parle de "smear" dans ce cas je pense).

a cette taille la, généralement pas loin du bleu de bromophénol si utilisé, ce sont plutôt les amorces


Il faut dans ta PCR test faire un contrôle positif.

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb753ced1]

a cette taille la, généralement pas loin du bleu de bromophénol si utilisé, ce sont plutôt les amorces


Il faut dans ta PCR test faire un contrôle positif.

Oui tout à fait, les amorces !

[invite8a029766]

C'est à dire ? Tu n'as aucune amplification du tout, même pas celle attendue ?

oui même pas celle attendue!! j'attendais avoir une amplification au niveau du réactif contaminé!! Mais rien de rien!!

[piwi]

Ce serait chouette d'avoir une photo pour s'en assurer, mais ce doit effectivement être les amorces. Dans ce cas, ce n'est pas une contamination, mais simplement le signe que vous n'avez rien amplifié.

Cordialement,
piwi

[invite8a029766]

a cette taille la, généralement pas loin du bleu de bromophénol si utilisé, ce sont plutôt les amorces.

Il faut dans ta PCR test faire un contrôle positif.[/QUOTE]

[Flyingbike]

en gros tu veux déterminer quel réactif est responsable de ta contamination.

Donc ce que tu fais est bien, mais si jamais tu n'as aucun signal sur ton gel (comme c'est le cas visiblement), tu ne sauras pas si c'est une absence de contamination ou simplement une PCR qui n'a pas du tout fonctionné (donc faux négatif).
Il faut donc faire une condition avec de l'ADNc pour s'assurer que la PCR a fonctionné ET qu'il n'y a pas de contamination dans un des puits.

Après il est aussi possible que les contaminations observées ne proviennent pas d'un des réactifs mais simplement du fait de la manipulation de l'ADN a proximité du contrôle négatif. Ca peut expliquer pourquoi dans une PCR sans ADN tout soit blanc.

[invite8a029766]

a cette taille la, généralement pas loin du bleu de bromophénol si utilisé, ce sont plutôt les amorces


Il faut dans ta PCR test faire un contrôle positif.

oui justement, le loading buffer contient le bleu de bromophénol! Pourrais tu m'expliquer d'avantage? Merci d'avance

pour le contrôle positif, pourrais tu me dire comment le faire et surtout qu'est ce que ça doit m'apporter?

[Flyingbike]

Le bleu de bromophénol est juste un colorant qui migre comme l'ADN pour suivre l'avancement de la migration. C'est une petite molécule qui migre a peu près à la même vitesse qu'un petit fragment d'ADN. Les bandes d'ADN que tu vois sont les amorces non utilisées dans la réaction et se retrouvent a peu pres a la hauteur du bleu.

Pour le contrôle positif regarde la réponse précédente.

[invite8a029766]

en gros tu veux déterminer quel réactif est responsable de ta contamination.

Donc ce que tu fais est bien, mais si jamais tu n'as aucun signal sur ton gel (comme c'est le cas visiblement), tu ne sauras pas si c'est une absence de contamination ou simplement une PCR qui n'a pas du tout fonctionné (donc faux négatif).
Il faut donc faire une condition avec de l'ADNc pour s'assurer que la PCR a fonctionné ET qu'il n'y a pas de contamination dans un des puits.

Après il est aussi possible que les contaminations observées ne proviennent pas d'un des réactifs mais simplement du fait de la manipulation de l'ADN a proximité du contrôle négatif. Ca peut expliquer pourquoi dans une PCR sans ADN tout soit blanc.

d'accord, merci je vois ce que tu veux dire! et pour les bandes qu'on voit en bas du gel et que tu explique par le fait qu'il s'agit des amorces, est il normal qu'elles soient présentes, en supposant que la PCR s'est bien déroulée?

[Flyingbike]

Ca dépend, souvent on les voit encore, mais généralement plus (+) lorsqu'il n'y a pas d'amplification.

[invite853321bf]

Si ta PCR fonctionne bien et est bien optimisée, ta concentration d'amorces est suffisantes pour l'amplification, donc une fois que ta PCR est faire, elles seront devenues les amplicons, donc tu as plus beaucoup d'amplicons. Sachant que ce sont quand même de petits fragments, il y a peu de molècules de BET qui peuvent se fixer dessus. Donc pour que tu vois tes amorces, faut que t'en aies beaucoup. Même beaucoup trop. Ca peut aussi expliquer tes problèmes d'amplification si les amorces ont été mal designées, ou pas faites en ce sens. Il se peut qu'il y ait des dimérisations, cad qu'elles s'hybrident entre elles. Dans ce cas, elles ne sont plus dispo pour l'amplification. Ca peut arriver si ta température d'hybridation est trop basse. Tu peux essayer de l'augmenter.

[invite98ab1ae6]

Il n'y a pas que des reactifs, comme source de contamination!
Il y a les pipettes, par exemple. Et puis aussi juste une contamination venant de l'air (ca depend de ce que tu amplifies, en effet).
Sinon, tu pouvais aussi avoir une contamination avec des amplicons. Quand tu ouvres 1 tube apres PCR, tu peux creer un aerosol d'amplicons, et si qq'un est en train de preparer sa PCR a ce moment a la paillasse d'a cote... Tu vois le topo.

Est-ce que ta contamination est reproductible?

Courage, ce n'est qu'un mauvais moment a passer!

Sacha