PROBLEME Tm PCR

[invitef44c5647]

Bonjour,

Je suis censée introduire des sites de restriction par PCR.
Je rencontre plusieurs problèmes :
- mon amorce sens ne finit pas par un G ou C mais par un AT.
- j'ai une différence de température de fusion (Tm) de 5°C entre l'amorce sens et l'antisens.
- j'ai une différence de 3 nucléotides entre mes deux amorces (21 contre 24pb).

Si j'ajoute un G en 3', mon Tm augmente de 5° ce qui me fait une différence entre mes deux amorces de 10°C !!!!!!!

Est-ce vraiment gênant?
Que faire pour y remédier?

Merci à tous!
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[invitee863e61a]

Bonjour,

Je suis censée introduire des sites de restriction par PCR.
Je rencontre plusieurs problèmes :
- mon amorce sens ne finit pas par un G ou C mais par un AT.
- j'ai une différence de température de fusion (Tm) de 5°C entre l'amorce sens et l'antisens.
- j'ai une différence de 3 nucléotides entre mes deux amorces (21 contre 24pb).

Si j'ajoute un G en 3', mon Tm augmente de 5° ce qui me fait une différence entre mes deux amorces de 10°C !!!!!!!

Est-ce vraiment gênant?
Que faire pour y remédier?

Merci à tous!

A mon avis, cela est moins gênant que d'avoir un A ou un T en fin d'amorce. Si vous amorces sont bien spécifiques de vos cibles (cela dépend de vos matrices aussi), il ne devrait pas y avoir trop de soucis.