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Problème RT-PCR sur cDNA



  1. #1
    xavierdaniel85

    Problème RT-PCR sur cDNA

    Bonjour...
    J'ai un petit souci d'intron/exon
    Apres une RT-PCR (donc effectuée sur des ADNc, donc sur des ARNm matures...?) j'ai séquencé l'amplifiat, et je retrouve certaines bases qui appartiennent normalement à des introns, plus précisément aux signatures gtag des introns...
    Quelqu'un a t'il des informations à m'apporter ?
    Merci !

    -----


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  3. #2
    piwi

    Re : Intron et exon

    Il faut trois choses pour exciser un intron.
    une séquence (A/C)AG|GU(A/G)AGU en 5'
    une séquence (U/C)AG|G en 3'
    et une séquence (U/C)NCU(A/G)AC dans l'intron.

    J'ai noté par | les sites de coupure et la A en gras dans la séquence intra-intronique est nécessaire.

    Donc, le fait de trouver l'une ou l'autre de ces séquences n'est pas significatif du fait que l'on est dans un intron. Il faut les trois.

    Ensuite, si l'on trouve les trois, je pense qu'il ne faut pas s'alarmer et envisager la possibilité d'un épissage alternatif.

    Enfin, ca n'est que mon avis.
    Cordialement,
    piwi

  4. #3
    Annaick_R

    Re : Probleme RT-PCR sur cDNA

    Je suis d'accord avec Piwi, si tu trouves une séquence qui ressemble à un intron dans ton amplifiat, c'est probablement de l'épissage alternatif.

    Par la façon dont tu exposes ton problème, j'ai l'impression que tu ne connais pas la structure exacte intron/exon de ton gène... J'imagine que c'est pour ça que tu séquences le cDNA. Une chose est sûre : entre les prédictions des sites d'épissages et une preuve biologique (ADNc séquencé), c'est la preuve biologique "qui gagne".

    Conclusion, soit tu as une erreur de prédiction de la structure intron/exon de ton gène, soit tu as un epissage alternatif, soit tu as séquencé de l'ADN génomique (contamination de ta prep' d'ARN) -> As-tu fait un traitement à la DNase ?...

    Annaïck.

  5. #4
    xavierdaniel85

    Re : Probleme RT-PCR sur cDNA

    merci pour cette réponse
    malheureusement (ou heureusment pour la suite de mes recherches) le probleme est plus compliqué, puisque
    j'ai séquencé deux sortes de cDNA, et seul l'un d'eux contient les "cicatrices" d'introns...je devrais peut etre poursuivre la piste d'un épissage alternatif ?

  6. #5
    Borh

    Re : Probleme RT-PCR sur cDNA

    Une autre possibilité c'est que tu amplifies un cDNA issu d'un ARN non mature (dont l'epissage n'est pas fini). Pour conclure, je te conseille de prendre un kit d'extraction qui élimine les ARN nucléaires et qui séléctionne uniquement les ARN cytoplasmique.

    Une autre possibilité : un Western Blot avec un anticorps specifique du peptide que donnerait cet intron s'il était traduit. Si le Western est positif alors tu auras prouvé que cet intron est inclus et tu pourrais même estimer la quantité avec un anticorps contrôle spécifique d'une autre partie de ta protéine.
    Dernière modification par Borh ; 25/04/2006 à 19h54.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    piwi

    Re : Probleme RT-PCR sur cDNA

    L'idée du western est pas mal du tout sur le papier, mais faire l'anticorps monoclonal n'est pas si simple.

    M'enfin j'aime bien l'idée quand même.

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  10. #7
    Annaick_R

    Re : Probleme RT-PCR sur cDNA

    si je comprends bien, tu as séquencé l'ADNc "normal" correspondant à la prédiction de la structure du gène et des ADNc qui sont presque pareils mais avec des "glissements" des sites d'épissage ce qui laisse une "trace d'intron" entre les 2 exons attendus.

    Question 1: les traces d'introns correspondent à 1 bout d'intron (qq bases) ou à un intron entier non épissé ?

    Question 2: comment sont répartis ces glissements ? Un par séquence ou plusieurs ?

    Question 3: combien de séquences différentes "avec glissement" as-tu obtenu ?

    Si tu retrouves toujours les mêmes "cicatrices" (=intron "mal" épissé), c'est bien de l'épissage alternatif, avec des sites donneurs et/ou accepteurs alternatifs qui enlèvent une partie de l'intron habituel. Il y a des logiciels qui prédisent la force des sites d'épissage selon le contexte des base comme NetGene2 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/
    Rq: il ne marche que pour des gènes humains, de C.elegans ou d'A.thaliana.

    et GeneMark HMM (gènes eucaryotes et procaryotes) http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark/hmmchoice.html


    Annaïck.

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