Problème de PCR

[invited193aaa7]

Bonjour,
j'ai un problème de PCR, je vais essayer de vous expliquer le mieux possible, mais attention c'est un casse-tete!!
nous essayons d'isoler de l'ARN de virus dans des LB pour cela nous faisons une extraction d'ARN totaux, une RT avec des oligos spécifiques, puis une première PCR puis une seconde qui ressert le cadre.

Lors que nous avons fait sa sur nos nouveaux patients, nous n'avions rien en PCR1 et 2, juste une bande en dessous de 100pb (surement les amorces ...) au lieu de la bande attendue à 1700pb.
Donc nous avons décidé de repartir d'anciens patients qui fonctionnaient super bien cet été. La encore nous n'avons rien eu.
Nous sommes donc repartis des extractions d'ARN, des ADNc et des PCR1 de cet été et nous avons obtenus des smear (une énorme bande très difuse) qui se trouve de 0 à 700pb en PCR1 et de 1000 à 3000pb en PCR2 avec une tendance a être un peu plus fort au niveau de 1700pb (bande attendue).
Pour essayer de remédier à ce problème, nous avons fait l'extraction avec 2 kits diffèrents (viral et RNeasy de qiagen) et avec la superscript II, III et primescript pour la RT. Sa n'a rien changé.
Nous sommes donc parti des anciens PCR1 qui donnaient des "patates" en PCR2, nous avons eu encore notre smear. Nous avons donc commandé de nouveaux primers, ce qui a pour ainsi dire rien changé.
Des PCR qui n'ont rien à voir ont été faites pour tester l'enzyme (Phusion), le tampon de l'enzyme, l'eau et les dNTP, tout a très bien fonctionné.
Nous sommes repartis d'une plasmide de cet été en faisant un gradient de température et de concentration et tout a fonctionner, donc nous l'avons fait avec nos ADNc (qui fonctionner cet été) et nous avons eu que des smears.
Nous avons essayer aussi de purifié le gel en PCR1 et PCR2 en prenant que ce qui ce situe entre 1000 et 2500 pb, mais nous avons que des bandes à 100 et 150 pb, ce qui correspond surement aux amorces seules ou hybridées entre elles.

Voila notre problème, j'espère que vous pourez nous aider, et surtout n'hésitez pas à poser des questions !!
-----

[invitea5ce7ce1]

Salut,
La deuxième PCR que vous faites est une nested? Est-ce que vous avez essayé de diluer les amplicons de la PCR1? Même diluer ton échantillon initial en cDNA?
Je faisais des nested et j'avais le même problème. J'ai fait une série de dilutions et j'ai retrouvé (pour une dilution au 200e si je me trompe pas) la bande recherchée. Je n'ai jamais réussi cependant de perdre les bandes correspondantes aux amorces qui apparaissaient après PCR2.
Bon courrage

[invited193aaa7]

bonjour,
oui c'est une pcr nested, nous avons essayer de diluer nos échantillons mais jusqu'au 1/20e et nous n'avions rien qui apparaissait.
J'essayerai peut-être, alors, des dilutions plus fortes.
Merci

[invited193aaa7]

Bonjour,
les dilutions n'ont pas fonctionné, donc je suis encore ouverte à toutes suggestions !!
Merci d'avance

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea174bdb9]

hello,
Pour ma part, ce même probleme m'est arrivé sur une pcr classique. Il a été résolu tou simplement en changeant mes amorces. Ou tu peux aussi essayer de diminuer tes concentration en MgCl2( sa c la solution pour le même probleme d'un copain). salut

[invited193aaa7]

Bonjour,
les amorces ont été changées et sa n'a rien donner sinon en ce qui concerne de MgCl2, nous en mettons pas, les PCR avaient toujours fonctionner sans, et mon maitre de stage m'a dit que c'était pas la peine d'essayer avec, donc je suis un peu coincer sur cette question.

[invitea5ce7ce1]

Salut,

Vous traitez à la DNase après extraction? T'en parle pas?

[invitea5ce7ce1]

Re-,

Je viens de penser à autre chose aussi. Est-ce que tu as un témoin positif de ta PCR? Ca te permettra de cibler où est ton problème dans le mix ou dans les échantillons...

[invited193aaa7]

non nous ne traitons pas à la DNase mais nous nettoyons tout nos outils (pipettes, paillasse ...) à l'alcool et nous prenons des cones et eppendorf stériles.
sinon nous avons essayer des témoins positifs : un plasmide comprenant la s"quence que nous cherchons et sa fonctionne mais avec de l'ADNc qui fonctionner cette été sa ne fonctionne plus alors que les 2 sont faits en meme temps avec le meme mix.

[invite8c0cc995]

Même si ca ne résoud pas la compréhension de votre problème actuel, pourquoi ne pas chercher à amplifier un fragment plus petit, 300bp suffisent largement pour discréminer entre une amplification spécifique, et les dimers de primers.
Votre séquence est elle riche en GC, en structure secondaire ? car en plus de la taille de l'amplicon, cela peut aussi expliquer le fait que les enzymes décrochent de l'ADN.