Bonjour à tous,
Ayant des problèmes de PCR, j'ai déposé mes amorces sur un gel. Il s'avère que je ne vois pas une des amorces sur gel, or en dosant mon primer au Nanovue, j'ai une concentration forte. Comment expliquez-vous cela? Que me conseillez-vous pour ma PCR?
Cordialement.
Jo
Hello
Recommander des nouveaux primers ?
Soit faire ce que conseille ananda, soit tester des concentrations de votre amorce ayant un protblème.
Enfin, voir des amorces sur un gel c'est un peu la roulette russe quand même tellement c'est petit.
oui j'ai oublié de préciser que j'ai déjà recommandé ce primer, et toujours le meme résultat. Sinon je travaille avec des primers assez longs donc normalement visible sur gel.
Très bizarre cette histoire... Mais avez vous déposé plusieurs fois le primer? et testé un gel plus concentré en agarose pour être sur de le voir? Sinon combien de pb font les primers?
Tu dis que ta PCR a des problèmes : tu ne vois aucun signal ? des bandes parasites ? As-tu un contrôle positif ?
Correctement diluées d'après la fiche technique fournie avec les amorces, je ne vois pas comment les primers ne seraient pas visibles. En tout cas, je ne pense pas que le probleme vienne de "l'absence" de primers.
Est-ce que l'un des deux primers a déjà fonctionné dans une autre PCR ?
Y a-t-il moyen de tester individuellement chacun des primers avec un autre primer qui ne pose pas de problème (primer "commercial" par exemple : T7, M13, etc). Ex :
tu as tes primers X et Y qui ne marchent pas ensemble. En utilisant une matrice ADN adaptée, tu testes une PCR en utilisant le couple de primers X avec A, et Y avec B ; A et B étants des primers connus pour marcher.
Sinon, au prix des primers, autant en racheter
HelloEnvoyé par Flyingbike
Sinon, au prix des primers, autant en racheter
Il les a déjà recommandés, sans succès...
Je suis d'accord avec ananda, il faudrait déjà savoir quel type de problème ait rencontré, plus si ce sont des amorces fabriquées ou trouvées dans la biblio. Pour savoir s'il y a un point de référence
ce sont des primers d'environ 40 pb. Et non je n'ai pas de controle positif. C'est une PCR qu'on a jamais réussi a sortir (PCR très longue de 11kb). Je vous rassure, j'ai testé une taq long range.
Je pense que le mieux serait de designer un autre primer ailleurs. Je voulais savoir si qqn avait deja rencontré ce genre de problème. J'ai fait une réclamation auprès du fournisseur mais ils ne peuvent pas m'en dire plus
11 kb ? c'est pas vraiment de la PCR de routine et si ça ne marche pas je pense qu'il ne faut pas en vouloir au fournisseur. Il n'y a pas d'alternative à la PCR pour cette application ?ce sont des primers d'environ 40 pb. Et non je n'ai pas de controle positif. C'est une PCR qu'on a jamais réussi a sortir (PCR très longue de 11kb). Je vous rassure, j'ai testé une taq long range.
Je pense que le mieux serait de designer un autre primer ailleurs. Je voulais savoir si qqn avait deja rencontré ce genre de problème. J'ai fait une réclamation auprès du fournisseur mais ils ne peuvent pas m'en dire plus
Quelle est la matrice ? de l'ADN génomique, un plasmide ?
Comment on été désignée les amorces ?
11 Kb... comment dire
oui en effet c'est tres long!!!
Et à cette difficulté s'ajoute mon problème de primer. Je vais carrément designer un autre primer. Merci à tous pour votre aide.
A Flyingbike : je n'en veux pas au fournisseur parce que ma PCR ne fonctionne pas mais plutot parce que je ne vois pas mon primer sur gel. En fait, j'aimerais écarter un problème de mix. Sinon, je fais ma PCR à partir d'adn génomique. J'ai aussi pensé à la faire sur un BAC, à voir...
Une autre explication possible serait que vous ayez designé vos amorces sur une souche, puis testé vos amorces sur une autre. Parfois on ne peut pas faire autrement je suis totalement d'accord, mais on peut jouer de malchance et tomber sur une souche ayant des mutations dans l'une des deux zones.
Plus tous les problèmes pouvant se passer sur ce type de PCR longue...
Mais c'est vrai que ça peut expliquer un problème de PCR, mais pas la "disparition" d'un des 2 primers. Pour ça, je ne vois pas
Une autre approche serait de sous-cloner des fragments de ta région de 11 Kb (ex : 4 fragments de 2.75 Kb)...et de jongler pour recloner un fragment final de 11 Kb.
Ananda : comment ca jongler? Je ne comprends pas. Le problème c'est que je dois cloner ce fragment de 11kb.
jongler : une fois que tu as cloné des sous-fragments il faut les "réassocier" c'est à dire trouver un jeu d'enzymes de restrictions adéquat (sites uniques)
