Primers RT

[invite30157012]

Bonjour,
une question me pose problème et je ne trouve pas une réponse claire.... voilà je veux cloner le 3'UTR d'un gène dans un plasmide.
Je pars d'ARN total pour faire du cDNA puis j'ai une paire de primers pour la PCR, avec l'ajout de sites de restriction. J'ai utilisé le primer forward pour essayer de faire la RT avec donc un primer gène spécifique, mais au final, après PCR, rien!
Je vais donc essayer avec des oligo(dT) et peut-être aussi des random hexamers?... mais là je me pose la question avec ces derniers, produit-on un cDNA complet? ou des "morceaux" de cDNAs en fonction des endroits où les hexamers viennent s'hybrider? auquel cas cela n'a aucun interêt pour moi puisqu'il me faut au moins le 3'UTR en entier.... merci de vos conseils!
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[Flyingbike]

peut etre qu'un oligodT15 suffirait alors pour avoir le 3'UTR. Tout dépend de la taille qu'il te faut, pour avoir des tres gros transcrits tu peux rajouter les hexamères.

[invite30157012]

Ok merci de ta réponse, mais quand on utilise uniquement les hexamères, obtient-on le cDNA entier? c'est -à-dire est ce que les cDNAs commençant à différents endroits se rejoignent et sont "ligués" entre eux?

[piwi]

Oui.
Le mieux est d'utiliser OligodT et hexamères. Simplement parce que si vous avez des miettes de cDNA, vous pourrez vous assoir sur votre PCR. Mieux vaut avoir les cDNA entiers, vous êtes certaines d'avoir la région qui vous intéresse.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite30157012]

Merci de vos réponses. Juste pour vous dire qu'avec un oligo(dT)20 ça a très bien marché, j'ai une belle bande de 2kb correspondant à la partie 3'UTR après la PCR.