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Expériences en génétique…



  1. #1
    Bafnoc

    Expériences en génétique…

    Bonjour à tous! J’aimerai savoir si vous connaissez des expériences qui peuvent être réalisées dans le domaine de la génétique. Par exemple, l’isolation de l’ADN et son électrolyse… Alors si vous avez d’autres suggestions, elles sont les bienvenues!

    Aussi, je voudrais savoir comment rendre une bactérie E. Coli résistante aux antibiotiques. Je me demande ça parce que mon frère, qui a 17 ans, va réaliser cette expérience dans son école.

    Merci pour vos réponses,
    Bafnoc

    -----


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  3. #2
    piwi

    Re : Expériences en génétique…

    Bonjour,

    Pour l'isolation de l'ADN tu pourrais presque le faire chez toi.
    il te faut de la proteinase K (j'ai bien dis presque hein!)
    du phenol/chlorophorme (50/50)
    de l'ethanol 100.
    Then go!

    Tu dilues pK dans un tampon salin (si il te faut la composition exacte je peux te la donner) à 0,25 mg/ml. (tu peux faire ca à la louche aussi ca marche quand tu a l'oeil)
    tu prends le volume d'une tete d'epingle de ton tissu (animal ou vegetal mais je ne sais pas si il ne faut pas ajouter une etape pour les plantes du fait de la paroi cellulosique)
    et tu rajoutes 0,5 ml de ta pK. Tu mets ca une nuit à 55°C
    Le lendemain tu ajoutes 0,5mL de phénol/chlorophorme (ca brule atrocement au contact de la peau attention.) et tu centriguge ca un bon coup 5 mins.
    Tu recupères la phase supérieur et tu ajoute 1 ml d'ethanol 100.
    Tu agites et là miracle! Tu vois l'ADN apparaitre sous la forme d'une petite pelotte blanche.

    Voilà l'experience est tres simple mais demande un peu d'equipement. Il me semble que sur un site internet j'avais vu un protocole carrément accessible au "commun des mortels". Ca vaudrait le coup de chercher un peu parce que c'est sympa je trouve.

    Pour l'electrolyse ca demande un peu de materiel ce coup ci.


    Pour la bactérie c'est assez simple. On fait entrer dans la bactérie un morceau d'ADN circulaire qui porte un gène qui code pour une protéine qui empechera l'antibiotique d'agire.
    Pour faire rentrer le gène on peut utiliser une méthode assez simple qui est un choc de temperature. On place les bactéries dans un millieu tres froid. On ajoute l'ADN, on les place ensuite dans un milieu chaud un tres court instant et ensuite de nouveau au froid.
    Le hic, c'est qu'il faut un peu preparer les bactéries avant et que toutes les bactéries ne peuvent pas etre préparées ainsi.

  4. #3
    Bafnoc

    Re : Expériences en génétique…

    Salut Piwi, merci de ta réponse. J’aimerai toutefois savoir si le morceau d’ADN, qui est intorduit, ne contient que le gène qui code la protéine en question? Et comment isoler ce gène(la méthode d’extraction et la source de provenance)? Je ne pense pas qu’on peut effectuer une telle expérience chez soi, même s’il l’on a un minimum de matériel, est-ce que je me trompe?
    Sincèrement,
    Bafnoc

  5. #4
    Noun

    Re : Expériences en génétique…

    Salut,

    sur ce lien, il ya a un protocole d'extraction d'ADDN d'onion que l'on peut faire avec dans sa cuisine sans equipement complique, l'auteur propose d'autres protocoles simples dans le menu
    http://georges.dolisi.free.fr/Microb...tion%20ADN.htm

    Noun

  6. #5
    globule

    Re : Expériences en génétique…

    Je fais mes extractions d'ADN avec des solutions hypersaturees en sel, et rince l'ADN avec etOH 100%... ca marche tres bien. Mieux vaut eviter de jouer dans sa cuisine avec du phenol/choloroforme

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    piwi

    Re : Expériences en génétique…

    re salut,

    je te conseille effectivement, et ce le plus vivement que je peux, de tenter l'extraction cuisine à partir de l'oignon.

    Ensuite non, pour extraire le gene dans ta cuisine ca me semble mal engagé.
    Sur le fragement d'ADN il n'y a pas que le gène en effet.
    En fait, ton gène va etre entouré avec des sequences particulières, uniques dans l'ADN introduit et que l'on pourra couper grace à des proteines spéciales (qui coutent chères ce qui exclue la manip' fait avec l'argent de poche ^_^)
    Avant cela il aura fallu separer l'ADN circulaire introduit de celui de la bactérie. Il ya plusieurs methodes qui necessitent un peu d'equipement.

    Une fois que tu l'as et que tu l'as coupé tu vas le faire migrer sur un gel d'agarose (+ du bromur d'ethidium) parcouru par un courant electrique. La migration de l'ADN dans le gel va se faire en fonction de la taille. Comme tu as coupé ton gene tu as deux bouts, un grand qui migre lentement et un petit (ton gène en principe) qui migre plus vite.
    Le bromur d'ethidium est un produit qui se fixe sur l'ADN et qui une fois en place devient fluorescent dans les ultra violets. Tu vas donc pouvoir voir tes deux bouts d'ADN dans le gel sous une lumière UV.
    Tu peux à present decouper le gel au niveau du petit bout.
    Une technique un peu astucieuse peut te permettre de le recuperer. Pour cela il te faut un petit tube que tu vas percer et aufond duquel tu vas mettre un peu de coton. Tu mets dedans ton morceau de gel et tu places ce tube dans un autre tube. Enfin, tu centrifuges tres rapidement. C'est ton coton qui va te servir de filtre, l'agarose ne passera pas le coton alors que l'ADN si. Tu retrouveras donc ton ADN dans l'autre tube.
    Il ne te reste plus qu'a le purifier comme on te l'a expliqué.

    Tu vois, ca se fait difficilement dans une cuisine.

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  10. #7
    Mouette666

    Re : Expériences en génétique…

    Citation Envoyé par piwi
    Pour faire rentrer le gène on peut utiliser une méthode assez simple qui est un choc de temperature. On place les bactéries dans un millieu tres froid. On ajoute l'ADN, on les place ensuite dans un milieu chaud un tres court instant et ensuite de nouveau au froid.
    Euh en general pour intégrer l'adn à une bacterie, on passe plutot par un virus ( le lambda est bien) dans le quel se trouve en plus les genes de toutes les proteines necessaires à l'integration de l'adn au genome. (pour la technique c'est un peu complexe...) Sinon je sais qu'on peut mettre aussi l'adn et les bacteries ensemble mais les transformations (integration de l'adn externe dans le genome) sont rares, en general on ajoute du Na+ a l'ext pour perméabilisé la membrane cell.

    Citation Envoyé par piwi
    Une fois que tu l'as et que tu l'as coupé tu vas le faire migrer sur un gel d'agarose (+ du bromur d'ethidium) parcouru par un courant electrique. La migration de l'ADN dans le gel va se faire en fonction de la taille. Comme tu as coupé ton gene tu as deux bouts, un grand qui migre lentement et un petit (ton gène en principe) qui migre plus vite.
    Le bromur d'ethidium est un produit qui se fixe sur l'ADN et qui une fois en place devient fluorescent dans les ultra violets. Tu vas donc pouvoir voir tes deux bouts d'ADN dans le gel sous une lumière UV.
    Et la je ne suis pas vraiment d'accord: en general pour trouver un gene specifique, on utilise plutot une sonde radioactive (adn (ou arn) complementaire du gene à identifier, marqué radioactivement, par exemple, au phosphore 32). Pour cette methode, il faut denaturer l'adn apres la migration, en general, par la soude...
    En effet, le BEt te permet de trouver ton gene si tu connais sa taille ET qu'il n'y a pas trop de brin (pas de smire)...
    Voila j'ai peut etre pas été tres clair

  11. #8
    piwi

    Re : Expériences en génétique…

    non là c'est moi qui ne suis plus du tout d'accord.
    Tu ajoutes des genes de selection dans des bactos via des phages toi? C'est pas du tout la pratique courante en labo.

    Quant à la permeabilisation je ne l'ai pas detaillée mais là encore ca n'est pas du Na+ mais du Ca2+.

    Pour recuperer le gene le fait de l'hybrider (peu importe comment) n'apporte rien.

    L'idée c'est plutot de purifier le plasmide dans un premier temps, d'extraire l'insert grace aux enzymes de restriction. Si tu travailles proprement je ne vois pas pourquoi tu aurais du smir infernal. Sur une telle manip' je n'en ai jamais eu moi. La petite technique pour recuperer la bande est plutot sympa je trouve. Et en plus elle fonctionne. Apres tu as d'autres facons de recuperer et d'optimiser le rendement.

  12. #9
    P'tite_fleur

    Re : Expériences en génétique…

    Pour l'extraction d'ADN : quelques conseils : L'oignon c'est bien, mais ça sent fort. Je l'ai fait, et mes mains ont senti l'oignon pendant 3 jours ... Ça marche très bien aussi avec la tomate ou le kiwi. En plus on voit mieux la différence entre la phase acqueuse rouge ou verte et la phase organique incolore.

    Pour l'autre question, je crois que pour rendre des bactéries résistantes à un antibiotique on peut faire une culture de ces bactéries sur milieu liquide avec l'antibio dilué, puis d'augmenter peu à peu la concentration. Vous allez sélectionner des bactéries résistantes. Et hop ! Démonstration du danger d'utiliser trop d'antibiotiques et de stopper un traitement trop tôt.

  13. #10
    Vinc

    Re : Expériences en génétique…

    Salut!
    Citation Envoyé par Mouette666
    Euh en general pour intégrer l'adn à une bacterie, on passe plutot par un virus ( le lambda est bien) dans le quel se trouve en plus les genes de toutes les proteines necessaires à l'integration de l'adn au genome. (pour la technique c'est un peu complexe...) Sinon je sais qu'on peut mettre aussi l'adn et les bacteries ensemble mais les transformations (integration de l'adn externe dans le genome) sont rares, en general on ajoute du Na+ a l'ext pour perméabilisé la membrane cell.
    Oui alors là je crois qu'il y a effectivement quelques confusions. Si tu veux transformer une bactos rendu compétente (par du Ca2+ et non pas par du Na+), tu as plusieurs possibilités dont le choc thermique (celle que j'utilise habituellement) qui consite en un passage d'environ 45 secondes à 42°C, ou également la lipofection, l'électroporation, etc....Tu as encore d'autres techniques qui te permettent d'insérer de l'ADN dans une cellule : projection à haute pression avec de l'ADN attaché sur des microparticules d'or, précipitation au phosphate de calcium, micro-injection, etc...
    Tu peux utiliser des phages mais comme l'as dit Piwi ce n'est pas la méthode la plus courante et ça va dépendre du type de phage (lytique, lysogénique), de la taille de ta séquence, etc....


    Citation Envoyé par Mouette666
    Et la je ne suis pas vraiment d'accord: en general pour trouver un gene specifique, on utilise plutot une sonde radioactive (adn (ou arn) complementaire du gene à identifier, marqué radioactivement, par exemple, au phosphore 32). Pour cette methode, il faut denaturer l'adn apres la migration, en general, par la soude...
    En effet, le BEt te permet de trouver ton gene si tu connais sa taille ET qu'il n'y a pas trop de brin (pas de smire)...
    Oulala.....bon alors ce qu' a dit Piwi, c'est qu'en routine dans les labos, on utilise des gels d'agarose (en général de 0,5 à 2 ou 3%) pour visualiser l'ADN par électrophorèse. Lorsque tu fais ton gel, tu ajoute du BET qui est un intercalant de l'ADN et qui va donc te permettre de "voir" tes molécules. Il n'y a pas besoin de connaitre la taille du gène (d'ailleur tu fais migrer de l'ADN ou de l'ARN et pas forcément un gène) car tu fais migrer un marqueur de taille à coté. On utilise l'électrophorèse par exemple pour contrôler les manips que l'on fait. Par exemple si tu veux voir si un gène que tu as voulu insérer est bien présent dans un plasmide, tu peux faire une restriction en coupant dans le gène hypothètique et tu calcules la taille des fragments obtenus en supposant que ton gène est présent : l'électrophorèse te permet de vérifier que les fragments sont bien ceux attendus et que tu as donc bien inséré ta séquence (ça n'est bien sûr pas la seule application).
    Pour ce qui est du P32, on peux l'utiliser "in vivo" pour visualiser (par exemple) des protéines ou des acides nucléiques dans la cellule. Ce dont tu parles c'est de l'hybridation in situ et ça ne s'utilise pas avec un gel mais sur une cellule vivante.
    En ce qui concerne ta remarque sur les smires, je crois que là encore il y a confusion, un smire est une visualisation de la dégradation par les DNases de ton ADN que tu retrouves en bas de ton gel.

    A+
    Vinc
    Primum non nocere.

  14. #11
    Yoyo

    Re : Expériences en génétique…

    Pour ce qui est du P32, on peux l'utiliser "in vivo" pour visualiser (par exemple) des protéines ou des acides nucléiques dans la cellule. Ce dont tu parles c'est de l'hybridation in situ et ça ne s'utilise pas avec un gel mais sur une cellule vivante.
    Piwi parlait probablement des tecnhiques de northern ou southern blot, qui te permet d'identifier un fragment contenant ton gel d'interet apres hybridation de la sonde radioactive.
    YOyo

  15. #12
    piwi

    Re : Expériences en génétique…

    Randons à Cesar ce qui est à Cesar: ce n'est pas moi qui parlait de sondes radioactives mais Mouette666.

    Ceci dit je crois qu'il faut recentrer la question.
    Bafnoc nous demandait comment rendre une bactérie resistante à un antibiotique puis dans un second temps il demandait comment isoler le gène de resistance en question. (et en relisant la question je me rends compte qu'il ne demandait sans doute pas comment recuperer le gène mais d'où provient il et comment a t on fait pour l'identifier et le récuperer.)

    J'ai donc un peu repondu de travers à la question en expliquant comment recuperer un gène introduit dans une bactérie grace à un plasmide. Dans ce cas là, comme on connait le plasmide, il n'y a pas à chercher à identifier le gène. On connait la taille du fragment de restriction, c'est tres simple.

    Maintenant quand l'on connait un gène et que on veut l'identifier dans le genome on peut effectivement proceder par hybridation type southern blot. Dans ce cas l'hybridation radioactive est effectivement la methode courante.

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  17. #13
    Vinc

    Re : Expériences en génétique…

    Salut!
    Quand j'étais plus jeune, j'avais fait une extraction d'ADN de banane (dans ma salle de bain ) mais ça marche plutôt bien avec d'autres fruits ou légumes...
    Je vais essayer de retrouver le protocole.

    A+
    Vinc
    Primum non nocere.

  18. #14
    Bafnoc

    Re : Expériences en génétique…

    Bonjour!
    Le but, si je comprends bien, est de prendre un gène d’une bactérie résistante et le transmettre à une bactérie non résistante aux antibiotiques. La partie que je ne comprends vraiment pas, c’est l’isolement du gène à partir d’une cellule, et dans ce cas-ci la bactérie. Mais comment arriver à extraire ce gène et comment l’identifier. Je suis seulement en quatrième année de secondaire et donc, je ne comprends pas parfaitement les techniques énumérées.
    Merci de répondre,
    Bafnoc

  19. #15
    Vinc

    Re : Expériences en génétique…

    Salut!
    Bon alors en fait je n'ai pas très bien compris ce qui te pose problème mais je vais essayer de te ré expliquer.
    Les gènes de résistance aux antibiotiques, que possèdent les bactéries, sont situés sur ce qu'on apelle des plasmides. Un plasmide c'est de l'ADN circulaire (en général) qui ne fait pas partie du chromosome bactérien. Ce plasmide possède des gènes qui globalement sont considérés comme annexes par rapports aux gènes du chromosome bactérien : les gènes des plasmides sont sensés s'exprimer dans des conditions particulières et sont, en temps normal, inutiles pour la bactérie.
    Les plasmides peuvent se transmettre de bactéries en bactéries et c'est à cause de ça qu'une bactérie, qui au départ est sensible à un antibio, peut devenir résistantes aux antibiotiques....Donc je crois que tu l'as compris : le processus de résistances aux antibios se fait naturellement.
    Maintenant si tu veux isoler un gène de résistance, c'est autre chose!
    Il existe de très nombreux plasmides différents et beaucoup ont été modifiés par génie génétique, car les plasmides sont utilisés comme vecteurs de clonage. On connaît donc la séquence de beaucoup de plasmides. Si tu connais la séquence d'un gène, c'est très facile de l'isoler, il suffit de faire une PCR avec des amorçes encadrant le gène et c'est finit!
    Sinon comme l'a dit Piwi au début de la discussion, tu peux aussi récupérer ce gène en coupant le plasmide (pour sortir le famaux gène de résistance) puis faire migrer le tout, récupérer le gène sur ton gel (en découpant la bande qui correspond au gène isolé sur ton gel) et enfin purifier l'ADN que tu as récupéré.

    A+
    Vinc
    Primum non nocere.

  20. #16
    P'tite_fleur

    Re : Expériences en génétique…

    Alors, reprenons au début : la résistance aux antibiotiques est une capacité naturelle des bactéries. Elles possèdent, en plus de leur génome circulaire assez grand et en une seule copie, des petits bouts d'ADN circulaires, eux aussi, mais beaucoup plus petits et en quantités variables (de quelques copies à plusieurs centaines).

    Ces plasmides ont une propriété supplémentaire : il permettent aux bactéries de se "conjuguer". Ce n'est pas de la reproduction, comme pour les organismes plus évolués, mais celà permet aux bactos de se coller l'une à l'autre et d'échanger certains de ces plasmides. C'est ainsi que si on mélange des bactéries résistantes à l'antibio A et d'autres résistantes à l'antibio B, elles deviennent "multirésistantes", c'est-à-dire que chaque bactérie est résistante aux deux antibiotiques.

    En biologie moléculaire, on utilise ces plasmides pour intégrer des morceaux d'ADN dans des bactéries rendues "compétentes", c'est-à-dire "perméables", l'ADN rentre tout seul dedans grâce à un choc électrique ou un choc thermique.

    Les gènes de résistance aux antibiotiques portés par ces plasmides naturels ont été caractérisés il y a un bout de temps, et on les utilise maintenant pour sélectionner les bactéries ayant reçu le fragment d'ADN voulu.

    On extrait alors l'ADN des bactéries, en prenant soin de ne garder que les plasmides, et de se débarasser du chromosome bactérien.
    On utilise alors des enzymes qui coupent l'ADN au niveau de séquences précises et connues (enzymes de restriction). Ensuite on fait migrer l'ADN sur gel d'agarose, en fonction de sa taille, et on le révèle aux UV grâce à une molécule fluorescente, le Bromure d'éthyduim (BET).
    Comme on connait la séquence du plasmide, et donc la taille du fragment attendu, on peut le retirer du gel (par diverses techniques, si tu veux en savoir plus, je peux t'en expliquer une ou deux) et le recoller dans un autre plasmide à l'aide d'une enzyme appelée "ligase" ou le séquencer ...

    Bien sur tou celà n'est faisable qu'en labo
    Celà répond-il à ta question, ou y a-t-il un autre point que tu voudrais voir éclairci ?

  21. #17
    P'tite_fleur

    Re : Expériences en génétique…

    Arf, grillée !

  22. #18
    Vinc

    Re : Expériences en génétique…

    Citation Envoyé par P'tite_fleur
    Arf, grillée !
    Ha oui désolé.... ! A une minute près en plus.....c'est rageant
    A+
    Vinc
    Primum non nocere.

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