Pb de Taqman sur miRNA

[invitee74e042e]

Bonsoir,
Je ss en stage de master et je fais des RTqPCR sur des micro ARN. J'ai un soucis avec mes courbes d'amplification, elles commencent bien lineaires mais a la fin au lieu d'avoir un plateau, les courbes font les montagnes russes. Je pensais que ça pouvais venir de la quantité d'ADNc que je met au depart qui est peut etre trop importante (40ng) et qui fini par saturer l'enzyme.
Si l'un de vous a l'habitude de ce genre d'experience et qu'il connait un peu le troubleshooting de ce type de manip je ss interessé. En effet je ne sais pas si je peux interpreter le Ct de ce type de courbes qui finissent bizarre.

Merci d'avance.
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[invite853321bf]

Serait il possible d'avoir une capture de l'écran de tes courbes ? La dernière fois que j'ai vu des "montagnes russes" c'est qu'il n'y avait eu aucune ampli, ce que je détectais était le bruit de fond.
Après, toujours le même problème, qu'appelles tu au juste montagnes russes ? Une capture serait très utile pour t'aider

[invite71f23525]

Il n'y a aucun souci d'avoir ce genre de profil en "montagne russe" avant et après la phase linéaire d'amplification. Normalement tu as aussi ce profil avant le Ct, lorsque l'appareil ne détecte que du bruit de fond. Je ne sais pas à quoi c'est dû mais ça ne perturbe en rien la qualité des résultats (sauf pour la partie avant le Ct, il faut faire attention que la ligne seuil ne soit pas placée trop basse sinon une bosse peut toucher la ligne seuil et le calcul du Ct défini sur cette base...).

Ce qui est important est d'avoir une bonne pente dans la phase linéaire d'amplification, ce qui témoigne d'une bonne efficacité de la qPCR, et aussi d'avoir de bonnes courbes de fusion, qui te renseignent sur la qualité de tes primers ainsi que leur spécificité dans une moindre mesure.

[Edelweiss68]

Il n'y a pas de courbes de fusion en Taqman non ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite853321bf]

Non, ce n'est pas possible, la courbe de fusion repose sur la "lecture" de la température à laquelle le double brin s'ouvre par le relargage du fluorophore entrainant une chute de la fluorescence.
Taqman ne repose pas sur une chimie intercalante.

Il est vrai qu'avec des "vieux" logiciels, effectivement on avait des courbes bizarres avant d'atteindre le début de la phase exponentielle. Enfin je dis logiciel mais c'était peut être (du au matériel plus qu'au logiciel). Maintenant quelque soit la chimie que j'utilise, j'ai des belles droites bien planes avant et après ma phase expo.

[invitee74e042e]

Ok, tout dabord merci a tous pour vos reponse et de l'interet que vous portez a mon pb.
Ensuite,
@Kamor : dsl, je ne peux pas te faire de capture d'écran pour l'instant.

Je peux juste vs dire que le début est "normal" mais qu'a la fin au lieu
d'avoir un plateau ça oscille bizarement mais de façon caractéristique (meme profil d'oscillation sur deux exp et sur des miRNA differents). C'est ce qui m'amene a penser que c'est peut etre l'enz qui s'épuise ou que l'un des reactif devient limitant... ...
J'assiste a un topo d'un mec d'applied biosystem demain, peut etre que je pourrais avoir la solution là bas (jvous tiens au courant)
@LXR : c'est pas un pb de bruit de fond c'est sur, puisque les courbes monte haut en fluo avant d'osciller. Si je suis ce que tu dis alors je peux utiliser ces resultats puisque j'ai une bonne linearité. Ce qui me chagrine c'est que je pense que ces oscillations sont prise en compte dans le choix du threshold par le software. Comment etre sur que ces oscillations n'influence pas les Ct...?
Je vais sans doute réessayer dans la semaine avec deux fois moins de matrice au départ (20ng au lieu de 40). Donc si ça marche mieux jvous le dirai, j'essaierai de faire les captures d'écran aussi pour etre plus precis. Si d'ici là vs avez d'autre idées je suis preneur.

A+ et merci!

[invite71f23525]

J'ai été trop rapide pour répondre, je n'avais pas vu que tu étais en Taqman. Je parlais de la qPCR en SyBR green, désolé.

[invite30157012]

Salut,

je fais régulièrement des RT-qPCR de micro-ARNs avec le système de Applied, je n'ai pas d'oscillations après l'amplification, seulement avant lorsqu'on est dans le bruit de fond ou quand je n'ai pas d'amplification... Je ne sais pas trop ce que ça peut être, mais si tu veux m'envoyer ton protocole détaillé depuis la RT (perso je fais une RT globale avec le pool de primers de RT) peut-être que je pourrais avoir une idée... Et en effet la capture d'écran pourrait nous aider à nous faire une meilleure idée!
Bon courgae

[invitee74e042e]

hello ts!
@LXR : ok c'est pas grave^^ tkt.

@Delphinette: je travail aussi avec les pool de primer miRNA de chez applied (RTmegaplex) on bosse dc sur la mm chose. J'ai été a un seminaire d'un Mr de chez Applied et il a dit qu'il viendrait au labo la semaine prochaine... a suivre dc.
Je suis dsl de pas avoir le temps de vous mettre le protocol et les imprécran mais dès que possible je le fait! (d'ici la fin de la semaine).

A+

[invitee74e042e]

Voila, je suis pas un pro de la piece jointe, dc j'espere c'est bon mais voici mes courbes taqman.


28-02.GIF

3-03.GIF

Proto RTqPCR (mon proto maison avec mes ptites rmq d'etudiant de master1 lol, dsl ca fait un long message):

RT-qPCR relative de miRNA :

1) Dégeler les composes sur la glace : ARN du -80 et dNTPs buffer et primer du -20 (vortex and spin VnS).
2) Préparer le master mix :

Pour RT d’un miRNA pour 10 tubes
Nuclease free Water : 2
10X Reverse Buffer : 8
100nM dNTPs : 2
RNase inhibitor (20U/uL) : 1
MgCl2 : 9
Primer speq/Megaplexpool 10x : 8uL
MuRTase (50U/uL) : 15
Total : (VnS)

3) Centrifuger pour faire tomber les gouttes et mettre sur la glace
4) Mettre chaque ARN dans les tubes 0.2 correspondants (avec 1 a 10ng d’ARN) : ici 3uL et 4.5uL de MMix
5) Ajouter le Mmix (en ratio 5/10 ARN/Mix soit 15uL ds un tube)
6) Incuber sur glace (au moins 5min) pendant qu’on règle le thermo cycler. Les 5min permettent à la sonde loop de prendre sa structure secondaire (critique !!!)

7) Lancer la RT : thermo cycler 30min 16C, 30min 42C, 5min 85C, incub 4C. Tot 2h30

8) Diluer les produit RT en ajoutant 91.5uL aux 7.5uL de produit.
(soit une concentration hypothétique de 990ng/7.5uL ou 132ng/uL dilues a 10ng/uL on prendra 2uL ou 4uL pour qPCR soit une quantité de 20ng ou 40ng)
Rmq : on admet ici que tous le materiel RNA a été retrotranscrit en ADNc (en realite reaction ne se fait pas a 100%)


Taqman : qPCR avec sonde fluo (temps : plaque=1h, run=1h30)

le type de fluo (FAM).

Taqpol hot start : 10min a 95C
Cycles (40) : 15sec 95C (denature), 60sec 60C (hybridation, et elongation)
Pas de 4C puisque les résultats sont acquis ds la machine.

9) Préparation en tube 1.5 Mastermix Taqman (dans l’ordre, sur la glace):

MasterMix Pour la Reaction qPCR (pour 15puits cf.plan de plaque, pas de marge d’erreur car T-)
Nombre de puits : 1
Nuclease free water 2.5uLou0.5
Mastermix universel Taqman2X 5uL
Taqman miRNA assay20X 0.5 uL
Total 8 uL

10) Dispenser chaque cDNA dans la plaque selon le plan prévu. (pipettage vertical en touchant le fond, changer de cône si reste des gouttes dedans, verifier par-dessous la plaque si tt est la)
11) Ajouter le Master mix (pipettage contre la paroi pour pas avoir a changer de cône)
12) Ajouter les strip
13) Mettre la plaque et lancer la machine
14) Extraire les données (Ct) sur excel pour analyse.

[invite30157012]

Salut Goulletech

En effet l'allure de la fin de tes courbes est étrange. Perso je n'observe pas ça. Je ne pense pas que ça affecte le calcul de tes Ct pour autant.
Quelle quantité d'ARN mets-tu au départ dans la RT? 990 ng c'est ça?
Bon moi je dilue mes ARNs à 200 ng/µl et je fais comme toi, 3 µl pour 4,5 µl de mix de RT, donc ça fait 600 ng d'ARN. A la fin de la RT je dilue en rajoutant 67.5 µl d'eau, donc je suis à 8ng/µl théoriques d'ADNc. Pour ma PCR, je la fais dans un volum final de 20µl par puit avec seulement 1,3µl d'ADNc, c'est-à-dire environ 10 ng. Donc je mets 10 µl de taqman 2x, 7,7 d'eau, 1µl de primer, et 1,3 µl de cDNA. Tout ça pour dire que je mets deux fois plus de réactif, pour deux fois moins de cDNA, et que je n'ai pas de problème. Peut-être en effet qu'il n'y a pas assez de dNTPs, de primer ou autre réactif dans ton cas...
Voilà, j'espère que cela t'aidera.
A+

[invitee74e042e]

Merci beaucoup Delphinette.
Deux fois plus de reactifs, et deux fois moins d'ADNc...voila qui est interessant et qui va en faveur de l' hypothese des reactifs limitants. sachant qu'en plus j'ai deja fait des taqman avec mon proto qui marche mais sur des micro arn tres faiblement exprimes...
Neanmoins, dans les imprime ecran que j'ai mis, entre les deux manip j'ai divise par deux la quantite d'ADNc (20ng contrairement a 40 pour la premiere). Et rien n'a l'air de vraiment changer. Ceci dit je suis encore concentre par rapport a tes 10ng dans 20uL vu que moi je suis ds 10uL. tout ca pour dire que j'en met plus du double.
Affaire a suivre... si quelqu'un a d'autres idee qu'il n'hesite pas.

A+

[invitee74e042e]

@delphinette : oui c'est bien ca pr la qutite de depart de la RT

[invitee74e042e]

Hello,
J'ai essaye ton protocole Delphinette, et la courbe de l'un des miR c'est amelioree, mais toujours pas de plateau, pire, mon normaliseur sRNA U6 ne sort pas (petite "vague" a la fin)! ... desesperant non? Dans l'imprime ecran qui suis on voit les details... est ce que je devrais changer de machine ?
Est ils possible que les echantillons que j'utilisent se degradent? (Les cDNA souffrent ils des decongelation/recongelations succesives?)

[invite853321bf]

Ce qui m'étonne sur ton graphe, c'est les unités en ordonnées (dR). C'est une dérivée de la fluorescence ?
Dans ce cas ça me rappelle un peu la Melt Curve. Tu observerais plus une vitesse de variation de la fluorescence que la fluorescence elle même.
Sur la droite tu as une liste déroulante "fluorescence", essaye de mettre simplement R ou quelque chose de ce genre, je pense que ça sera plus quelque chose qu'on a l'habitude de voir.

[invitee74e042e]

D'apres ce que je sais (je peux me tromper) mais dR c'est R moins la baseline, dc je pense pas que ce soit ca l'origine du pb .
Surtt que j'utilise cette echelle depuis le debut et que sur des mRNA j'avais vraiment des courbes jolies. Je vais verifier quand meme pour etre sur.

[invitea069fc56]

Comme l'a souligné LXR, la spécificité de tes primers et tes produits d'amplification doit être assurée pour éviter des courbes et des amplifications non spécifiques.
Est-ce que tes amplicons sont spécifiques aux gènes étudiés? Pas d'homologie importante avec d'autres séquences? Tes primers sont bien choisis en terme de hairpin, complémentarité de séquence..?

[invite853321bf]

Lors de la Taqman, le fluorophore est actif une fois que la sonde est détruite et il le reste. Rien ne peut expliquer cette diminution de fluorescence par une simple amplification aspécifique avec une telle technique.
D'un coup les quenchers reviennent se coller aux markers pour que la fluorescence diminue, puis le coup de foudre cesse donc ils se séparent ? Ce n'est pas logique...
Je ne connais pas suffisament ce logiciel pour être certain, mais je rejoins l'avis de LXR, si on lit vite et qu'on regarde les graphes sans en savoir plus, on pense Melt peak. Qui donne une vitesse de variation d'un paramètre. Ce qui colle avec une Taqman aussi.

[invitee74e042e]

Les primers sont designes par applied biosystem on les commande tt fait il n'y a aucun pb de ce cote la j'en suis sur.
Une autre personne a fait un Taqman different sur la mm machine aujourdui. Ca a donne des courbes etranges (il ne sagissait pas de microRNA) je n'ai pas pu avoir l'imprim ecran mais ca faisais un peu comme moi. Conclusion, il y a de forte chance pour que se soit la machine qui ait un pb (la lampe est peut etre en fin de vie). Demain je fais un mm taqman sur deux plaques differentes pour tester en parallele une autre machine et celle que j'utilise en ce moment... reponse demain donc!

[invite853321bf]

Ca serait quand même bizarre que ton détecteur ou émetteur ait des problèmes qui à chaque fois se passe aux alentours du 32-34ème cycle. Pareil pour le Pelletier.
T'es tu un peu plus renseigné sur le logiciel ?

[invite30157012]

Oui c'est bizarre cette fluo qui diminue quand même.
Je ne vois rien de flagrant dans ton protocole qui pourrait expliquer cette diminution. En revanche je confirme que j'utilise le même protocole avec les primers de chez applied, et ça marche très bien. J'utilise leur machine PCR (7300) et le logiciel d'analyse qui va avec. Voici ci-joint le type de courbes que j'obtiens (en linéaire et log).

[invitee74e042e]

C'est definitivement un probleme de machine, voici la comparaison :
machine pb.GIF

deuxiememachine check8-03.GIF

Certes les miR sortent tard sur la bonne machine (c'est pour ca que je les concentraient dans ma reaction, plus que delphinette, pour qu'ils sortent a un Ct plus faible). Mais on voit clairement que la machine que j'utilisait pose un probleme : meme plaque, meme experience et meme les temoins sont problematiques!
J'ai ma reponse dc. Je vais pouvoir m'attaquer a mon projet en esperant ne plus avoir de panne de machine. Merci a tous d'avoir cherche avec moi! Au moins si quelqu'un voit ce type de diminution de fluo etrange, il pourra penser a un pb de machine maintenant.

@Kamor : non le logiciel ne pose pas de probleme, deltaR ne correspond pas a une derive de fluo mais bien a ce que je disais (moins la baseline). D'ailleurs il me semble que Delphinette a aussi des DRn sur ses graphes.Sinon, c'est quoi un Pelletier?
Je pense qu'on peut en theorie avoir une diminution de la fluo sans que les sonde viennent se recoller a l'ADN : meme si la sonde est degrade sa fluorescence ne doit pas etre infini, elle doit finir par diminuer, qu'est ce t'en pense?

@Delphinette : merci pour ton aide, une question subsiste neanmoins : tes cDNA sont moins concentres que moi mais tu a des Ct plus faibles, alors qu'on travaille avec le meme matos... tu a une machine de chez applied, moi une stratagene... c'est peut etre ca. J'espere trouver le bon mix reactionnel pour avoir des courbes taqman miRNA aussi belles que les tiennes

Je posterai des infos si les gens de stratagene qui vont etudier le probleme de la machine en donnent.

[invite853321bf]

Ma faute j'ai oublié de me relire, c'est Peltier.
Le peltier est le nom du principe physique qui te permet de faire fonctionner ton thermocycleur. Par extension ce le nom qu'on donne au bloc chauffant.

Quand on dit que la sonde se dégrade, ça veut dire que l'amorce faite d'acide nucléiques est lysée et donc le quencher et l'émetteur qui se trouvent à chaque extrêmité de cette sonde sont libérés. La sonde ne peut donc pas recoller à l'ADN.
La fluorescence n'est surement certes pas infini mais elle n'est pas impactée le temps d'un run. Sinon dans le cas du Sybr Green, la réalisation des Melt curve serait un peu compliqué Elle peut diminuer mais de manière prévisible et linéaire selon la température.
Et le profil en dent de scie est quand même atypique même en évoquant un problème matériel.

Perso, j'ai eu une fois un problème avec mon thermocycleur, j'ai contacté le SAV. Ils sont souvent très au courant des petits problèmes que peut rencontrer leur machine et prêt à aider.

[invite30157012]

Bonne nouvelle alors! C'est curieux quand même cette machine qui ne marche pas! D'autres personnes l'utilisent??
Sinon pour les Ct, tu as deux échantillons qui sortent bien. Ce sont tes contrôles peut-être? Moi j'utilise RNU48 comme standard de normalisation. Sinon les Ct que j'obtiens sont variables en fonction des miRs, il m'est arrivé d'en tester des très peu exprimés et ils ne sortent pas aussi tôt (voir par du tout ) que dans mon exemple. Après, si tu regrades toujours les mêmes, c'est sûr que tu peux otimiser ton protocole pour voir sortir tes Ct plus tôt.
Bon courage.