Mutagenèse dirigée : pas de mutants

[invitece790f8f]

Bonjour à tous,

Je suis actuellement en stage dans un laboratoire d'enzymologie, et mon but est d'étudier les paramètres des mutants d'une enzyme. Les expériences de mutagenèses sont faites avec le kit de chez aligent technologie, "Quickchange II". Le souci est qu'au bout de 2 mois je n'ai toujours pas de mutants et que je commence à sérieusement m''inquiéter pour la suite.
Si quelqu'un a déjà été dans ce cas, ou si quelqu'un a une explication, votre aide me serait très précieuse.

Pour ce qui est des manipulations, je fais tout comme indiqué dans le protocole et à la fin j'obtiens des clones sur mes boîtes. D'après ce qu'on me dit, le nombre de colonies est correct (il semble que quand il y a trop de colonies c'est mauvais signe, et que dpn I n'a sûrement pas agi). Pourtant, quand je fais une miniprep et que j'envoie à séquencer, je vois que tous les clones dont j'ai purifié l'adn plasmidique sont des sauvages. J'ai fait trois fois l'expérience avec à chaque fois 3 acides-aminés différents donc en tout 9 expériences de mutagenèse, pour chaque boîte je fais les minipreps et le séquençage d'environ une cinquantaine de clones pour minimiser le risque de rater des mutants..Et Rien !

Mon problème c'est que non seulement je n'ai pas de clones à étudier, donc pas de résultats à exploiter, mais qu'en plus je ne comprends pas pourquoi ça ne marche pas, et je ne sais pas quelles réponses donner quand on me demandera comment je pourrais faire pour améliorer l'expérience de mutagenèse, ou au moins d'analyser la cause de l'échec.
Je me sens assez ridicule et le moindre conseil me sera d'une grande aide !
Merci d'avance !
-----

[invite326288e4]

bonjour,

je ne suis pas spécialiste en la matière mais la première idée qui me viens est est-ce-que tu es sur de l'état/la qualité de tous tes réactifs?? je ne sais pas s'il sont tous fournis avec le kit...

je sais pas ca pourrait être une première piste...

[invitec9f0f895]

Salut

Normalement le kit marche tres bien on a aux alentours de 80% de reussite au labo. Mais dans certains cas il faut s'y prendre autrement.
Voici quelques pistes/questions:
- qu'elle est la taille de ton plasmide? (plus c'est petit mieux ca marche).
- Verifies tu tes amplifications sur gel? (nous quand on voit rien, ca ne marche pas).
- diminue la quantité de matrice, comme ca la DpnI aura moins d'ADN a couper.
- ta mutagénèse ne fait pas disparaitre un site de restriction par hasard?

Bon courage
Yoyo

[invitece790f8f]

Merci pour vos réponses..
Alors, oui tous les produits proviennent du kit, qui est assez neuf donc les réactifs sont à priori bons.
Le plasmide fait 5.4kb, vous pensez que c'est beaucoup ?
Ensuite, non je ne vérifie pas mes amplicons sur gel, mais ne verrait-on pas l'adn parental quoiqu'il en soit ? en quoi ça donne une indication du succès de la mutagenèse ?et comme le mutant et le parent sont censés avoir la même masse je n'y ai pas pensé..
pour le site de restriction c'est pareil je ne comprends pas vraiment ce que ça change.. (dslée) C'est à dire que les mutants pourraient dans ce cas présenter une défaillance dans son traitement par les bactéries (circularisatrion, etc) ?
En tout cas je doute que pour les 5AA que j'ai tenté de muter, qui sont à des endroits bien distincts de l'enzyme, il y ait ce même problème de suppression d'un site de restriction (mais je voudrais bien savoir pourquoi tu m'as demandé ça, yoyo).
et oui, la prochaine fois je mettrai moins d'adn parental alors !

merci beaucoup !!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec9f0f895]

Merci pour vos réponses..
Alors, oui tous les produits proviennent du kit, qui est assez neuf donc les réactifs sont à priori bons.
Le plasmide fait 5.4kb, vous pensez que c'est beaucoup ?

Non ca me parait bien!

Ensuite, non je ne vérifie pas mes amplicons sur gel, mais ne verrait-on pas l'adn parental quoiqu'il en soit ? en quoi ça donne une indication du succès de la mutagenèse ?et comme le mutant et le parent sont censés avoir la même masse je n'y ai pas pensé..

A priori tu ne verras la matrice que si tu en mets beaucoup... par contre s'il y a eut amplification tu verras une bande assez intense. Autre solution tu déposes apres ta digestion à la DpnI comme ca tu es sure de ne voir que la PCR. Si tu la vois c'est que ta mutagénèse a forcément marchée (tes oligos ont tous la mutation).

pour le site de restriction c'est pareil je ne comprends pas vraiment ce que ça change.. (dslée) C'est à dire que les mutants pourraient dans ce cas présenter une défaillance dans son traitement par les bactéries (circularisatrion, etc) ?

Non, si jamais tu supprimais un site de restriction unique, tu pourrais t'en servir pour couper par l'enzyme pour encore plus éliminer le parental (c'est un doublon par rapport a la dpnI).

En tout cas je doute que pour les 5AA que j'ai tenté de muter, qui sont à des endroits bien distincts de l'enzyme, il y ait ce même problème de suppression d'un site de restriction (mais je voudrais bien savoir pourquoi tu m'as demandé ça, yoyo).

C'est peu probable, mais tu fais 5 mutagénèses d'un coup? si c'est le cas essaye les unes apres les autres ca marchera mieux

Yoyo