Mutagenèse dirigée

[invited6c7c491]

Bonjour, je suis etudiante qui est en train de faire un mutagenese pour un plasmide de 9.048kb, mais j'ai un grand probleme pour avoir le produit de PCR, j'ai designe les primers sur le site de stratagene et personnellement je l'ai calcule par le formule propose par le manuel de kit, tout est OK, les primers sont tous plus de 78C, le mutation porte en milieu de primer.
le premier fois pour PCR, j'ai fait exactement les conditions de PCR propose par le kit, 95C denaturation 2min au depart, 60C temperature d'hybridation et 68C temperature d'elongation pendant 5min, 18 cycles au total. Rien obtenu apres la transformation, j'ai verifie le produit de PCR par gel agarose, rien du tout.
le deuxieme fois j'ai modifie la temperature d'hybridation pour 68C, et le temps d'hybridation et d'elongation au total 12 min, toujours rien obtenu.
Alors, j'espere que vous pouvez m'aider a trouver le probleme. sachant que le quantite de plasmide ajoute pour PCR etait 100 ng. et je ne pourrais pas essayer toutes les conditions a cause de limit de quantite de kit. Merci a l'avance!
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[Flyingbike]

quel est le Tm des primers ?

[LXR]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

Evites de déterrer des sujets anciens. Il est préférable de créer sa propre discussion.

Bonne participation,

LXR pour la modération

[invited6c7c491]

Bonjour, j'ai 4 mutations a faire par ce kit, le Tm de chaque paire de primes est 79.93C (81.1), 80.22C (80.22C), 79.98C (80.3C) and 78.83C (80.02C), entre les parentheses, ce sont des Tm que j'ai calcule par le formule propose par le kit.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invited6c7c491]

Il y a une personne qui m'a repondu tres gentilement, il m'a propose de designer les primers pour un Tm de 55C, c'est a dire qu'il faut redemander de synthetiser les primers, hors ce n'est pas recommende par le kit. je ne sais plus...

[Yoyo]

Salut

Non il te suffit de prendre les primers que tu as mais de les utiliser a 55° ou 50°.

YOyo