Bonjour, je suis etudiante qui est en train de faire un mutagenese pour un plasmide de 9.048kb, mais j'ai un grand probleme pour avoir le produit de PCR, j'ai designe les primers sur le site de stratagene et personnellement je l'ai calcule par le formule propose par le manuel de kit, tout est OK, les primers sont tous plus de 78C, le mutation porte en milieu de primer.
le premier fois pour PCR, j'ai fait exactement les conditions de PCR propose par le kit, 95C denaturation 2min au depart, 60C temperature d'hybridation et 68C temperature d'elongation pendant 5min, 18 cycles au total. Rien obtenu apres la transformation, j'ai verifie le produit de PCR par gel agarose, rien du tout.
le deuxieme fois j'ai modifie la temperature d'hybridation pour 68C, et le temps d'hybridation et d'elongation au total 12 min, toujours rien obtenu.
Alors, j'espere que vous pouvez m'aider a trouver le probleme. sachant que le quantite de plasmide ajoute pour PCR etait 100 ng. et je ne pourrais pas essayer toutes les conditions a cause de limit de quantite de kit. Merci a l'avance!
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