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Mutagénèse dirigée qui ne fonctionne pas



  1. #1
    Manillelab

    Mutagénèse dirigée qui ne fonctionne pas


    ------

    Bonjour à toutes et à tous.

    Je rencontre depuis plusieurs temps de gros soucis pour réaliser ma mutagénèse dirigée alors je me décide à vous en parler...tout idée est la bienvenue.

    Voilà, j'ai un plasmide de 10Kb dans lequel je souhaite insérer 3 nucléotides à un endroit bien particulier pour créer un site de restriction. Une fois ce site de restriction présent j'insèrerai mon tag Flag. L'un des points limitant c'est que je souhaite insérer flag dans une boucle extracellulaire courte de ma protéine finale. Donc pas trop de marge de manoeuvre au niveau du DNA.

    Je me suis lancée dans une mutagénèse avec le kit LIGHTNING de Stratagène, designé des primers complémentaires (33pb)sur leur site selon leurs caractéristiques comportant mes 3 nucléotides, varié les concentrations en DNA lors de la PCR , la température d'annealing, les temps d'annealing et d'élongation, le nombre de cycles...bref, j'ai tout essayé, je vous raconte pas le temps que ça m'a pris. Les quelques bactéries rarements obtenues après transfo et action de la DpnI, ne poussaient pas ou très mal en milieu liquide, et quand miracle il y avait, elle contenait...que dalle! Contaminations résistantes à l'ampicilline (gène de résistance dans mon plasmide)..?
    J'ai passé le relais à ma collègue qui gère la plateforme de BM, idem pour elle avec le kit XL de stratagène également.

    J'ai fait de nombreuses haltes par le forum ici pour comparer et comprendre ce qui ne fonctionne pas, mais toujours rien.

    Changement de stratégie:

    L'idée maintenant c'est d'amplifier un fragment plus court (environ 3Kb) compris entre deux sites de restriction uniques (mais toujours autour de la zone qui m'intéresse bien entendue). Donc pour cela je design 2 paires d'oligos et réalise 3 PCR successives..
    PCR 1 : je génère le fragment en amont de ma mutation et la mutation se retrouve à l'extrémité 3'
    PCR 2: je génère le fragment en aaval de ma mutation et la mutation se retrouve à l'extrémité 5'
    PCR 3: je pool les deux premiers produits de PCR qui vont s'hybrider au niveau de la mutation et j'élongue grâce aux primers les plus extrèmes... ça va vous me suivez?

    Là arrive mes questions.
    Je n'ai absolument aucune expérience sur cette 2è stratégie que je ne connais que de façon théorique.

    1) Si PCR 1et 2 génèrent des fragments de tailles très différentes (500 et 2500 pb), cela n'a pas d'importance? A priori non mais bon...

    2) Si, soyons fou, je décide d'insérer Flag flanqué de mon site de restriction (le but est de pouvoir ensuite changé le tag comme bon me semble..quand on est fou on est fou!) tout entier à la place des 3 nucléotides et donc d'avoir dans mes primers "centraux" une extrémité libre strictement non complémentaire (pas d'hairpin et tout le bazar non plus)...est ce que l'encombrement risque d'être trop important, est ce que je débloque à fond les ballons..?

    3) Si mes primers les plus extrèmes contenant les sites de restriction uniques du plasmide ont leur séquence commençant directement par ces sites de restriction uniques, y a t-il trop de risques qu'ils soient modifiés (et donc que je perde mes sites de restriction) par une enzyme qui perdrait de sa fidélité justement là où je veux pas...c'est tiré par les cheveux mais bon, j'aimerais avoir votre opinion.


    Merci d'avoir tout lu...j'espère avoir été suffisemment explicite.

    -----

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  3. #2
    Yoyo
    coresponsable des forums

    Re : Mutagénèse dirigée qui ne fonctionne pas

    Citation Envoyé par Manillelab Voir le message
    ça va vous me suivez?
    Ce que tu veux faire est de la joined PCR, ca marche mais pas toujours evident.

    1) Si PCR 1et 2 génèrent des fragments de tailles très différentes (500 et 2500 pb), cela n'a pas d'importance? A priori non mais bon...
    Si ca a de l'importance, je prendrais des fragments de taille differente mais proches (300 et 500 par expl). le rendement de PCR depend directement de la taille du produit, donc plus c'est grand moins caa marche. De plus il te faut compter en nombre de molécule pour faire ta deuxieme pcr. Or un a une molarité identique un grand fragment est moins concentré. donc il te faudra ajuster tes concentrations en fonction.
    2) Si, soyons fou, je décide d'insérer Flag flanqué de mon site de restriction (le but est de pouvoir ensuite changé le tag comme bon me semble..quand on est fou on est fou!) tout entier à la place des 3 nucléotides et donc d'avoir dans mes primers "centraux" une extrémité libre strictement non complémentaire (pas d'hairpin et tout le bazar non plus)...est ce que l'encombrement risque d'être trop important, est ce que je débloque à fond les ballons..?
    de quel encombrement parles tu?

    3) Si mes primers les plus extrèmes contenant les sites de restriction uniques du plasmide ont leur séquence commençant directement par ces sites de restriction uniques, y a t-il trop de risques qu'ils soient modifiés (et donc que je perde mes sites de restriction) par une enzyme qui perdrait de sa fidélité justement là où je veux pas...c'est tiré par les cheveux mais bon, j'aimerais avoir votre opinion.
    La plus part des enzymes de restrictions ont besoin de quelques bases de part et d'autre du site pour se fixer a l'ADN si ton site est exactement a l'extremité de l'ADN beaucoup d'enzyme ne couperont pas du tout. ca va etre super galere.



    Merci d'avoir tout lu...j'espère avoir été suffisemment explicite.[/QUOTE]

  4. #3
    Petrucci

    Re : Mutagénèse dirigée qui ne fonctionne pas

    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    Ce que tu veux faire est de la joined PCR, ca marche mais pas toujours evident.

    La plus part des enzymes de restrictions ont besoin de quelques bases de part et d'autre du site pour se fixer a l'ADN si ton site est exactement a l'extremité de l'ADN beaucoup d'enzyme ne couperont pas du tout. ca va etre super galere.
    Entièrement d'accord sur tout. On en fait au labo en "routine" de la double joint et les problèmes dont tu parles Yoyo sont à prendre en compte avant de commencer.

    On s'est déjà fait avoir sur cette question de bases de part et d'autre des sites de restrictions...

  5. #4
    Manillelab

    Re : Mutagénèse dirigée qui ne fonctionne pas

    merci de vos réponses. j'essaye ça dès demain...

    Quand je parlais d'encombrement, je me disais qu'un primer de 68bp dont seulement 23 sont complémentaires risque d'avoir des difficultés pour s'hybrider...non?

    encore merci et bonne fin de journée.

  6. A voir en vidéo sur Futura
  7. #5
    Manillelab

    Re : Mutagénèse dirigée qui ne fonctionne pas

    me revoila pour une question, simple surment, mais à laquelle je n'ai jamais été confronté.
    Impossible de designer des primers avec un % en GC compris en 40 et 60 (pour mon cas j'obtiens 63 minimum en allant chercher loin..) Mon Tm est déjà largement torturé et ma longueur ne changerait rien, sauf empirer les choses.
    63% en GC peut être acceptable? Ca change quoi à part la covalence plus ou moins forte?
    merci

  8. #6
    LXR

    Re : Mutagénèse dirigée qui ne fonctionne pas

    Les appariements G-C entre les deux brins font 3 liaisons hydrogènes alors que les appariements A-T n'en font que 2. Donc plus on a un pourcentage en GC élevé, plus l'hybridation des deux brins est stable, donc plus le Tm est élevé. Si tu n'as que 23 bases sur 68 qui hybrident, alors le pourcentage en GC élevé sera plutôt avantageux. Sachant que ce sont surtout les premières étapes de PCR où seules 23 bases de ton amorce hybrideront à la matrice. Pour les étapes suivantes, l'amorce hybridera au produit des précédentes polymérisations, donc l'intégralité de l'amorce hybridera.

    Greg
    Dernière modification par LXR ; 02/06/2009 à 10h50.

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  10. #7
    Manillelab

    Re : Mutagénèse dirigée qui ne fonctionne pas

    Bonjour!

    juste une réponse rapide pour tenir au courant ceux que ça pourrait intéresser par la suite. CA MAAAAAAARCHE !!

    Bonne journée à tous!

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