Problème de PCR

[milou19]

Bonjour,
alors je vous explique mon problème, sur deux de mes ADN ma PCR marche pour certains exons et pas pour les autres exons alors que sur les autres ADN elle marche parfaitement bien pour tous les exons.
pour vous donnez plus de détails je réalise sur une même plaque la PCR d'un même ADN mais différents primers dans chaque puit donc différents exons et pour ces 2 ADN j'ai certains exons qui n'ont pas été amplifiés j'ai refais la PCR une 2ème fois pour ceux qui n'ont pas marché le même problème persiste j'ai certains qui ont donné et d'autres non.
Je voudrais savoir qu'est ce qui pourra inhiber la PCR de ces 2 ADN.
Merci de votre aide.
A bientôt.
-----

[invitef940923e]

D'ou proviennent les ADN ? Tu a peut être une mutations dans ces deux ADN ?
As tu du primer dimer là ou les amorces ne semble pas marcher ?

[milou19]

salut
se sont des ADN extraits à partir du sang total humain. non je ne pense pas que c'est une mutation parceque certains de ceux qui n'ont pas marché la 1ère fois, ils ont marché dans le 2ème essai d'autre part la mutation ne peut pas exister au niveau de plusieurs exons.
Merci encore une fois.

[invite75e918c6]

Peut être que l'enzyme de polymérisation s'épuise trop vite dù à la longueur de l'exon à amplifier?
Une limite de la technique de PCR atteint?

[A voir en vidéo sur Futura]

[milou19]

bonsoir,
non je ne pense pas aussi parce que sur les autres ADN ça marche parfaitement bien
merci

[invitea74316c7]

Les primers ont déja été testé sur d'autres séquence? y a t'il un contrôle?

[kamor]

J'ai du mal à comprendre : tes exons amplifiés ne l'ont pas été par le même couple d'amorces ? ou s'agit il de couples d'amorces différents ?

[milou19]

oui les primers marchent parfaitement bien sur les autres échantillons d'ADN

[milou19]

c'est effectivement le meme couple d'qmorces qui pour certains ADN marche alors que pour 2 ADN ça marche pas

[milou19]

j'ai eu des doutes concernant les 2 ADN qui parfois marche et parfois pas donc j'ai du mesurer leurs concentrations par nanodrop et voila ce que j'ai trouvé.
ADN1:
443ng/ul
DO 280=9.352
DO 260=8.878
260/280=0.95
ADN2:
186ng/ul
DO280=4.528
DO260=3.738
260/280=0.83

[kamor]

Techniquement le rapport doit être le plus proche possible de 2. Là je dirais que tu as des protéines.

[Flyingbike]

En effet ton ADN n'est pas "très propre". Il peut y avoir des interactions avec la réaction de polymérisation. Pourquoi ne pas refaire une extraction plus proprement ? Quelle est la méthode utilisée et l'origine des ADN ?

[invite77ed5d40]

Quand j'avais un exon qui ne fonctionnait pas pour un ADN, c'est:
-qu'il était délété homozygote pour cette exon
-qu'il y avait un polymorphisme à l'endroit où se fixe les primers
-mon ADN n'était pas propre comme le tien, il y a sans doute des inhibiteurs, et plus ton amplicon est long et moins il y a de chance que la PCR fonctionne; est ce que les amplicons, pour les PCR qui fonctionnent sur ces 2 adn, sont moins longs qui ceux qui ne marchent pas?

[invitea74316c7]

As tu essayé d'ajouter du DMSO par exemple? il se peut que ton exon aie des strctures secondaires

[milou19]

Bonjour,
j'ai essayer aujourd'hui en ajotant de le BSA à mon mix de PCR mais malheureusement le problème persiste. En fait je ne peux pas refaire l'extraction parceque je ne peux pas avoir un autre prélèvement de la meme patiente qui m'interesse énormèment. Y a t il pas une solution??
Merci encore une fois pour tous.

[kamor]

Tu peux repurifier ton extrait d'ADN. Soit par un lavage phénol chloroforme, soit par des kits.