Bonjour,
Je fais actuellement des mise au point de western blot et je me retrouve avec un profil de beta actine avec plusieurs bandes (bande en plus en dessous de la bande attendu). Avez-vous déjà eu un profil comme ça ? comment faire ?
Merci pour vos réponses
Généralement, il n'y a pas grand chose à faire à part changer d'anticorps. As-tu déjà eu une seule bande d'actine avec ce même anticorps? J'ai déjà rencontré ce problème avec un anticorps anti-actine, les bandes détectées juste en-dessous peuvent être des isoformes d'actine mais ça reste une hypothèse. Pour éviter les biais, le mieux est donc de prendre un anticorps plus spécifique qui ne détectera qu'une bande d'actine. C'est ce que j'ai fais et je n'ai plus de problème depuis des lustres.
J'ai effectivement déjà une seule bande d'actine mais avec une lignée différente. Qu'elle anticorps utilises-tu ?
Un anticorps monoclonal murin anti-actine de chez Millipore.
Est tu sur de la qualité de tes échantillons ? Je pense à de la protéolyse.
Tu devrais faire un gel coloré au bleu de coomassie pour voir si tu vois des bandes protéiques discrètes ou un smire.
et aussi : est ce que tu dénatures bien tes protéines, dans quel tampon ? quel est ton protocole de blocage ?
Salut,
Je rejoins sr sur le fait que tu as peut-être lysé des cellules déjà "souffrantes", car un profil de plusieurs bandes d'Actine peut être lié à de l'apoptose cellulaire.
Un Bleu trypan et observation au microscope pourra déjà te donner un premier apperçu de la viabilité de tes cellules avant de les lyser.
Bon courage
BenJ
