pb dosage ARNtotal spectro

[invited63638d3]

Bonsoir, j'ai un pb concernant mes extractions d'ARNtotal. Je travaille sur des cultures pures de Fusarium langsethiae et coculture F.langsethiae/Geotrichum candidum.
Après avoir prélevé un aliquot de la culture (5mL), plusieurs cycles de rincages/centrifugations, je broie la biomasse à l'azote liquide. Sur cette biomasse, j'extrais les ARNtotaux avec le kit GenElute Mammalian totalRNAkit (SIGMA). Quand ensuite je veux doser mon ARN extrait au spectro, j'ai des valeurs beaucoup trop faibles (0,004) voire négatives...Pourtant je mets 10µL d'ARN + 690µL d'eau, ce qui me parait déjà pas mal. Etant donné que je n'ai qu'un volume d'environ 45µL d'ARN, je ne peux pas en mettre bien plus pour le dosage.
J'ai fait ensuite un gel pour vérifier l'absence d'ARN suggérée par les dosages au spectro. Et pourtant, j'ai bien de l'ARN dans mes échantillons...Il faut cependant que je puisse doser mes ARN car après je fais un traitement DNase (but = qPCR, et mes amorces se fixent aussi bien sur l'ADN que sur l'ARN...). Théoriquement, je devrais encore doser après cette étape de DNase puisqu'il faut que je parte de la même quantité de matière pour faire mes RT. Le problème est que j'ai visiblement très peu d'ARN et donc après le traitement DNase l'ARN aura été dilué...

Que me conseillez-vous ? Dosage au nanodrop ? Je ne connais pas la limite de sensibilité du spectro que j'utilise.
Pensez-vous aussi que je doive utiliser un autre kit pour mes extractions ? (oui parce que je dois faire suite au stagiaire de l'année dernière, donc utiliser ce kit...mais il est fait pour cellules et tissus de mammifère, or je travaille sur les champignons...celà me laisse perplexe).
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[inviteb3bd5afc]

Salut,
Le Nanodrop me semble plus judicieux, est-tu sur de faire ton test à la bonne longueur d'onde?

[invited63638d3]

Oui oui, je dose à 260nm + 280 pour évaluer la pureté de mon échantillon

[invite954f36b6]

Bonsoir,

d'accord avec Goubixx, essayez déjà de faire le dosage sur vos mêmes échantillons mais sans dilution, avec un nanodrop. 0.004 c'est trop faible pour être fiable, il est possible que le nanodrop vous donne quelque chose de beaucoup plus important que ce à quoi on peut s'attendre en multipliant par le facteur de dilution.

Savez-vous comment faisait le stagiaire précédent, et les résultats qu'il obtenait?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec9f0f895]

Salut

Evidemment tu utilises des cuves en quartz j'espere
sinon ton probleme viens probablement du blanc que tu utilises pour le dosage.
Quant au nanodrop, il y a souvent un facteur 2 a 5 d'erreur par rapport aux concentrations reelles (une vrai galere pour les banques de transcriptomique).
Dans bien des cas un analyse en bioanalyseur est ce qu'il y a de plus fiable, mais encore faut avoir l'appareil.

YOyo

[invited63638d3]

Oui j'utilise des cuves en quartz

En ce qui concerne le stagiaire précédent, apparemment il dosait au spectro, en diluant dans l'eau comme j'essaie de le faire. Au niveau des résultats, je n'ai pas vraiment plus de précisions, car son cahier de labo est soit illisible quand cela est écrit en français, soit écrit en chinois...
Le blanc que j'utilise pour le dosage est l'eau que j'utilise pour diluer mes ARNtotaux lors du dosage...
J'aimerai beaucoup avoir un bioanalyseur...mais le labo où je suis ne dispose même pas d'un nanodrop, et depuis 3 semaine ne dispose plus non plus d'un spectro depuis qu'il est parti en réparation.
Nous sommes pas mal à avoir des manips qui "foirent" au labo (juste une salle est dédiée à la biomol, dans laquelle on manip des microorganismes, on fait des extractions ADN, ARN, des PCR, des gels...).

Et au niveau du kit utilisé, ne pensez vous pas que le fait qu'il soit fait pour cellules et tissus de mammifères peut faire diminuer la quantité d'ARNtotal que j'obtiens à la fin ?

[invite853321bf]

Attention aussi, sur certaines cuves en quartz, tu as un sens de lecture, non seulement il n'y a que deux parois utilisables mais si tu la tournes, tes valeurs seront différentes. Ca peut être une piste.
Les dilues tu ? tu le fais peut être un peu trop même si je pense que tu l'aurais déjà vérifié cette piste
Quand aux kits pour mammifères, non pas forcément étrange, les kits pour bactéries ont du mal avec les parois fongiques, faut mieux sortir la grosse artillerie.

[invited63638d3]

Les cuves ont été mises dans le même sens pour doser mes ARN que pour doser les ADN d'une collègue, donc de ce côté là normalement, pas de soucis.

Pour les kits, il existe des kits d'extraction d'ARNtotal pour champignons, ce ne serait pas mieux ?

[inviteb3bd5afc]

Mais tu a dit que tu retrouve ton ARN dans tes gels d'électrophorèse, donc le kit extrait bien l'ARN non?

[invited63638d3]

Oui je retrouve de l'ARN...mais je vois peu la bande qui correspond à l'ARN 28S. Je vois bien la bande qui correspond au 18S + smear = ARNm. (il faut dire aussi que je n'ai pas de marqueur de migration d'ARN, du coup je mets comme marqueur du marqueur 1kb ADN double brin alors les tailles les distances de migration de correspondent pas entre mes ARN et le marqueur).
Je me dis que peut-être le kit n'extrait pas l'ARN de façon optimale, ce qui expliquerait que je ne puisse pas le doser au spectro...

[invitec9f0f895]

Salut

Si tu le vois sur gel, tu dois etre capable de le mesurer au spectro, sinon c'est que ton spectro a un sérieux probleme.

YOyo

[invite28f6e6c6]

La dilution que tu utilises est trop forte. Pour ta migration avec l'ARN, laisse tomber le marqueur de taille car les tailles sont differentes entre ADN et ARN. Perso, dans ce cas la, je n'en mets pas de marqueurs de taille.
On peut voir les bandes 28S et 18S à partir de 50/100ng d'ARN totaux.

[invite7f1ed9f4]

Tu peux également utiliser la méthode de dosage au ribogreen si tu as un lecteur de plaque à fluorescence (FITC like). C'est rapide et ça marche bien.

Par contre, il faudra s'assurer de l'absence d'ADN génomique, et tu n'auras pas de ratio 260/280.... Ce qui pose problème.

Cela ne remplace pas le bioanalyseur mais si tu n'as pas de spectro assez sensible ou de nanodrop, ça peut être une bonne alternative afin d'obtenir un dosage précis.

Pour info, réalisant souvent un dosage au nanodrop vs ribogreen, il n'y a pas tant de différence ou de variation sur les titres obtenus, sauf dans le cas d'un échantillons très faiblement concentré pour lequel les contaminations (sels pour les colonnes, phénol pour le trizol) viennent interférer avec le spectre des ARNs.

[invite7f1ed9f4]

Salut

Si tu le vois sur gel, tu dois etre capable de le mesurer au spectro, sinon c'est que ton spectro a un sérieux probleme.

YOyo

Pas nécessairement, si le volume de mesure dans la cuve est trop important, la dilution de l'échantillon l'est également et résultat, la DO est trop proche de 0 pour être utilisée avec confiance, d'où le côté pratique du nanodrop...