RNA interference : siRNA, shRNA

[invite350f03c3]

Bonjour,
Je me posais des questions à propos de la RNA interference, utilisée comme un outil pour provoquer un Knock-Down. Je crois savoir que l’on peut produire l’interference soit en utilisant des siRNA soit des shRNA.

- Dans le cas de l’utilisation de siRNA, comment sont-ils injectés dans l’animal ? J’ai lu des articles où ils parlaient d’injections intraveineuses, comment les siRNA peuvent-ils ensuite passer la membrane plasmique ? Et si l’on souhaite avoir un effet sur des structures dans le cerveau, observe-t-on des problèmes liés au passage de la barrière hémato-encephalique ?

- Dans le cas des shRNA, la séquence codant pour le shRNA est contenu dans un vecteur, comment le vecteur est-il intégré dans l’animal ? A-t-on une insertion dans le génome (dans ce cas il serait possible de faire un genre de Knock-in), ou le plasmid reste-t-il simplement dans le nucleus, et exprime le shRNA ? (possibilité de passage à la cellule fille ?)

Merci d’avance pour votre aide !
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[invitecd2b33a6]

salut,

comment les siRNA peuvent-ils ensuite passer la membrane plasmique ?

Il existe des systèmes "d'éponges à proton" qui permettent la création d'un gradient électrochimique au niveau de l'endosome primaire, ce qui induit une migration de cl- et la lyse de l'endosome via la pression osmotique, d'où la libération de la molécule voulue dans le hyaloplasme.

Impossible de retrouver les travaux, mais ce système à été utilisé avec succès. Une esquisse du système :

http://www.google.fr/url?sa=t&source...OI71dA&cad=rja

[invite3c235e37]

Bonjour,

Dans le cas des shRNA, la séquence codant pour le shRNA est contenu dans un vecteur, comment le vecteur est-il intégré dans l’animal ? A-t-on une insertion dans le génome (dans ce cas il serait possible de faire un genre de Knock-in), ou le plasmid reste-t-il simplement dans le nucleus, et exprime le shRNA ? (possibilité de passage à la cellule fille ?)

En culture cellulaire, si le vecteur est un plasmide, il ne s'intègre pas dans le génome mais peut se répliquer. Cependant il risque d'être expulser si il n'y as pas de pression de sélection comme une résistance à un antibiotique. Le moyen le plus sure de faire une lignée stable est d'utiliser un vecteur lentivirus, qui intègre la séquence du shRNA (ou de n'importe quel gène) dans le génome. Chez l'animal, je ne sais pas trop mais je pense que les lentivirus fonctionne... a vérifier.

[Flyingbike]

- Dans le cas de l’utilisation de siRNA, comment sont-ils injectés dans l’animal ? J’ai lu des articles où ils parlaient d’injections intraveineuses, comment les siRNA peuvent-ils ensuite passer la membrane plasmique ? Et si l’on souhaite avoir un effet sur des structures dans le cerveau, observe-t-on des problèmes liés au passage de la barrière hémato-encephalique ?

Le siRNA in vivo est relativement peu utilisé a ma connaissance en comparaison du sh. Cependant il est possible de le faire rentrer dans les cellules comme on fait in vitro par des techniques d'électroporation (ca fonctionne sur la plupart des cellules et je connais des gens qui font rentrer des siRNA dans le muscle de souris par cette méthode).
On peut utiliser aussi (in vivo et in vitro) des agents polaires qui forment comme des gouttelettes entourant les siRNA et les rendant liposolubles, : lipofectamine, lipomax, et bien d'autres références.
On utilise aussi des produits qui neutralisent l'ARN(chargé) et qui le rend capable de rentrer dans les cellules : jet-PEI (utilisé aussi in vivo), PEI, etc.

- Dans le cas des shRNA, la séquence codant pour le shRNA est contenu dans un vecteur, comment le vecteur est-il intégré dans l’animal ? A-t-on une insertion dans le génome (dans ce cas il serait possible de faire un genre de Knock-in), ou le plasmid reste-t-il simplement dans le nucleus, et exprime le shRNA ? (possibilité de passage à la cellule fille ?)

En effet le shRNA a besoin d'un promoteur et d'autres séquences pour s'exprimer (moins "ready to use" que le si). On peut effectivement l'intégrer dans un vecteur adénoviral (qui ne s'intègre pas : effet transitoire) ou lentiviral (qui s'intègre, donc effet stable si on utilise une sélection des cellules ayant intégré le vecteur) ou AAV. Ces trois vecteurs sont utilisés en culture cellulaire et in vivo. Cependant, le tropisme de ces vecteurs est très variable selon le type cellulaire et la vitesse de mitose (un hépatocyte est très facile a infecter, un neurone est beaucoup moins susceptible) et l'inflammation liée a l'infection est à prendre en compte.

Il existe aussi des modèles d'animaux transgéniques shRNA. La séquence permettant l'expression du sh peut être en effet intégrée dans le génome, ce qui permet un silencing sans devoir faire de KO (donc transgénèse, plus simple a mettre en place que la recombinaison homologue). A ma connaissance ce n'est pas très courant.

Bien sur ceci n'est pas exhaustif

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite28f6e6c6]

Il y a toujours des problemes à faire passer des molécules à travers la barriere hémato encephalique.
Pour un shRNA, on utilise un lentivirus qui permet une intégration stable de la construction dans le génome et donc une expression stable du shRNA. S'il n'y a pas d'intégration, il n'y a pas d'expression.