Retard sur gel

[invite9b093746]

Bonjour,

Est-ce que dans une expérience de retard sur gel on peux faire interagir l'ADN avec tout un extrait de protéines?? Si c'est le cas comment peut-on savoir après de quelles protéines il s'agit??

Merci d'avance!
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[zimzum18]

Je pense qu'il faudra faire des purifications de protéines par la suite tout simplement.

[Flyingbike]

En fait on s'assure de la nature de la protéine d'intérêt en étudiant les effets d'un anticorps dirigé contre cette protéine. (dans le cas bien sûr où on a des candidats)
En effet, si le retard qu'on observe est bien spécifique a la protéine d'intérêt, l'incubation avec un anticorps dirigé contre peut avoir deux effets : soit le retard est décalé vers le haut (supershift) du a la taille du complexe, soit le retard disparaît, a cause de l'encombrement produit par l'anticorps dans l'interaction avec la sonde.

Si on ne connait pas la nature de ces protéines, c'est différent, et dans ce cas on peut utiliser d'autres techniques.

[Guillaume69]

Sinon, en absence d'anticorps, on peut aussi utiliser un extrait protéique qui ne possède pas la la protéine en question (Knock down, ou KO s'il est disponible), et observer une diminution / absence du retard.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

C'est possible mais beaucoup moins rigoureux. Si tu n'as pas de shift en situation KO, comment dire que c'est du a l'absence de protéine ou a ses conséquences ?

[bubux]

Salut,
moi je n'ai pas utilisé de retard sur gel mais pas mal d'électrophorèse 1D et 2D et la technique que j'utilisais pour caractériser les protéines c'était la spectrométrie de masse. Ca me semble être la méthode de choix pour identifier une protéine ab initio.
Bye

[Flyingbike]

oui, mais pas du tout pour étudier une interaction ADN-protéine.

[bubux]

oui effectivement d'après ce que je comprends du gel retard la protéine n'est pas présente là ou l'ADN a migré, c'est donc foutu pour la spectro de masse

[gorben]

Sinon tu peux utiliser un biacore a la place du retard sur gel, et passer tes proteines fixees en spectro de masse. En plus ca te permet de calculer les constantes d'associations/dissociations

[invite9b093746]

Merci a tous pour vos réponses!

Juste une autre petite question .
Lors de la purification utilisant un tag....dans ce cas 6his. C'est quoi l'avantage ou désavantage de faire une purif en conditions dénaturantes par rapport à la native??
Je vois pas à quoi ça sert de dénaturer :s

Merci d'avance!

[Flyingbike]

Il y a un rapport avec le gel shift ?
sinon je dirais que c'est pour ne purifier que la protéine taguée et pas celles qui interagissent avec elle.

[bubux]

Salut,
tu peux ne pas avoir le choix, si ta protéine est agrégée et le tag plus ou moins masqué, débobiner tout ça peut améliorer la purif.
Le fait de dénaturer les protéases peut aussi être un avantage sur la stabilité d'un échantillon sensible.
Le problême, et qui peut être insurmontable suivant la protéine, c'est la renaturation évidemment.
a+