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Clonage



  1. #1
    flotrip

    Lightbulb Clonage

    Bonjour a toutes et tous
    voici mon problème de clonage
    L'objectif de ce clonage est de "récupérer" une partie d'un vecteur, pour se faire une amorce foward a été faite pour pouvoir intégrer un nouveau site de restriction, l'amorce reverse elle doit intégrer plusieurs sites, l'insert que l'on doit obtenir doit faire environ 1500-1600bp
    le programme classique de PCR ne marchant pas, il a été modifié (étape d'hybridation passé de 52 à 50°C) c'est avec ce changement+ des variations de quantité d'ADN que j'ai réussi a obtenir 1-2 fois un très léger signal (sur gel agarose 1%+BEt), mais depuis plus rien, tout a été testé (augmentation du temps d’élongation, des concentrations en ADN, passage de l'étape d'hybridation a 50 et 45°C durant 2min et température augmentée, TA cloning) je suis donc dans une impasse puisque je n'arrive pas a obtenir cet insert, donc si vous avez des idées je suis preneur! merci

    -----


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  3. #2
    YouLab

    Re : Clonage

    Salut, quelle est ta matrice d'ADN? Le vecteur? Si oui je ne vois pas pourquoi tu as des souci.

    Ta température d'hybridation est faible, quel est le Tm de tes amorces? Peux tu nous donner la séquence de tes amorces pour les checker?

    Sinon pour une séquence comme ça si tu n'arrives pas par PCR tu peux la faire synthétiser ça ne te reviendra pas si cher au final.

  4. #3
    flotrip

    Re : Clonage

    Salut, oui la matrice est bien de l'ADN c'est un vecteur commercial
    Pour le Tm la boite qui les a synthétisé donne environ 72°C (par contre je ne peux pas te donner les amorces, car je suis en stage et le sujet est confidentiel).
    Je note l'idée de la synthèse qui je pense sera le dernier recours!
    merci de ta reponse

  5. #4
    YouLab

    Re : Clonage

    Vu ton Tm tu dois prendre un Th autour de 60°C ça sera déjà mieux. Je te conseille une taq haute fidélité hot start.

    Sinon ca vient peu être de tes amorces qui font des hairpines ou s'hybrident entre elles mais sans la séquence je peux pas de tire...

  6. #5
    flotrip

    Re : Clonage

    Citation Envoyé par YouLab Voir le message
    Vu ton Tm tu dois prendre un Th autour de 60°C ça sera déjà mieux. Je te conseille une taq haute fidélité hot start.

    Sinon ca vient peu être de tes amorces qui font des hairpines ou s'hybrident entre elles mais sans la séquence je peux pas de tire...
    Très bien merci de ta reponse (pour info actuellement j'utilise de la PfuII)

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    YouLab

    Re : Clonage

    De rien! Moi j'aime bien la invitrogen iProof taq, sinon qiagen hot start taq. Est ce que ton problème s'est résolu?

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  10. #7
    LXR

    Re : Clonage

    A une température aussi basse d'hybridation, la stringence étant moins forte il peut y avoir une formation de structures secondaires empêchant la PCR, sur les amorces ou sur la matrice. Essayes une température plus haute comme le recommande YouLab, à 60°C, cela peut résoudre ton problème.

  11. #8
    piwi

    Re : Clonage

    Il ne faut pas perdre de vue que la PCR n'a jamais fonctionné. Est-on certain que les amorces ont été bien designées? Une PCR sur vecteur doit fonctionner! Pourquoi avoir choisi un Tm aussi bas? quand vous annoncez 72C, ce sont seulement les parties qui hybrident évidemment. N'est ce pas? Les dNTP sont bons?
    Pour les Taq, il n'y a aucun intérêt à utiliser des Taq top moumoutte pour ce genre d'application. Une Taq classique suffit amplement.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  12. #9
    YouLab

    Re : Clonage

    Oui c'est bizarre que ça n'ait jamais rien amplifié tout de même. Si à 60°C tu n'as toujours rien il va falloir revoir les amorces...

  13. #10
    flotrip

    Re : Clonage

    Merci de vos reponses
    je note le Tm à 60°C pour essayer ça la semaine prochaine!
    Pour répondre à Piwi:
    oui les amorces ont été vérifiées, donc normalement pas de problème de ce coté!
    Le Tm de 72°C est effectivement la température des parties de l'amorce qui s'hybrident
    en ce qui concerne les dNTP, je pense qu'ils sont bons, d'autres personnes s'en servent (y compris moi pour d'autres manip) et ça marche
    et pour repondre à YouLab: le problème n'a pas été encore resolu (il est a l'arret pour l'instant) car c'est un pont donc.....le labo est vide!!
    je vais testé vos hypothèses la semaine prochaine et je vous tiens au courant! merci a tous

  14. #11
    YouLab

    Re : Clonage

    Tu n'as pas moyen de faire un témoin positif? Ca m'étonnerai vu que tu fais du clonage mais des fois on a un plasmide similaire qui traîne...

  15. #12
    flotrip

    Re : Clonage

    Citation Envoyé par YouLab Voir le message
    Tu n'as pas moyen de faire un témoin positif? Ca m'étonnerai vu que tu fais du clonage mais des fois on a un plasmide similaire qui traîne...
    Je ne pense pas que je puisse faire un témoin positif, cependant, l'objectif est de sortir 2 inserts de ce clonage et l'un marche très bien, et l'autre pose de legers problèmes!!

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  17. #13
    YouLab

    Re : Clonage

    Franchement si ça déconne arrêtez de perdre du temps et faites synthétiser la séquence. Pour 1500pb il y en a pour 500€, c'est vraiment rien! Et en plus vous pourrez vous amuser à mettre sites de restrictions, mutations, etc, ou vous voulez et à votre convenance.

  18. #14
    flotrip

    Re : Clonage

    effectivement je vais faire le test au Tm 60°C et s'il n'y a (toujours) rien je lancerais l'idée!

  19. #15
    YouLab

    Re : Clonage

    Le seul souci ce sont les délais qui sont de 2 à 3 semaines...

  20. #16
    flotrip

    Re : Clonage

    le délai c'est pas trop un problème, du moment que le resultat est là

  21. #17
    YouLab

    Re : Clonage

    Ah bah en faisant séquencer ya pas de souci ta séquence sera bonne... Dans mon labo certains n'étaient pas fan de la méthode car trouvaient ça trop cher mais au final quand tu met bout à bout toute's les dépenses plus le temps passé tu te rends compte que c'est TRES rentable!

  22. #18
    flotrip

    Re : Clonage

    merci de ton aide!

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  24. #19
    YouLab

    Re : Clonage

    De rien! Bon courage pour tes manips!

  25. #20
    flotrip

    Re : Clonage

    Bon et bien la PCR a Tm 60°C n'a rien donné..... :'-(
    j'ai lancé ce soir une PCR avec différentes concentrations en Mg2+ et Cl- on verra ce que ça donne demain!

  26. #21
    YouLab

    Re : Clonage

    Bon bah moi je parie sur un souci d'amorces!

  27. #22
    flotrip

    Re : Clonage

    lol je te tiendrais au courant si un jour ça marche!!

  28. #23
    YouLab

    Re : Clonage

    OK, bon courage en tout cas! Pas facile les manips quand ça ne va pas aussi bien que sur le papier...

  29. #24
    flotrip

    Re : Clonage

    Bon et bien idem rien! la commande de gène synthétique est faite!

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  31. #25
    YouLab

    Re : Clonage

    Vous avez commandé ça chez qui?

  32. #26
    flotrip

    Re : Clonage

    hahaha! revirement de situation! la séquence ne peut pas etre synthétisée à cause de longue portion de G/C qui rende la synthèse impossible.....j'ai fait hier une PCR avec 5% de DMSO et une première étape de PCR a 94°C durant 3min puis en cycle (94°C 45 sec, un gradient pour la temperature du Tm de 50 à 70°C, et l'elongation)-->suspense! rien!! Si vous avez de nouvelles idées avec ces nouvelles infos je suis preneur!!!
    merci

  33. #27
    YouLab

    Re : Clonage

    En ayant la séquence ça serait plus facile... A mon avis tu as des structures II qui empêchent l'hybridation de tes amorces.

  34. #28
    Svenn

    Re : Clonage

    Citation Envoyé par flotrip Voir le message
    hahaha! revirement de situation! la séquence ne peut pas etre synthétisée à cause de longue portion de G/C qui rende la synthèse impossible.....j'ai fait hier une PCR avec 5% de DMSO et une première étape de PCR a 94°C durant 3min puis en cycle (94°C 45 sec, un gradient pour la temperature du Tm de 50 à 70°C, et l'elongation)-->suspense! rien!! Si vous avez de nouvelles idées avec ces nouvelles infos je suis preneur!!!
    merci

    Dans le cas ou ton insert code pour une protéine, il n'y a pas moyen de faire de l'optimisation de codon pour arriver a un taux de GC plus raisonnable ? Ca faciliterait la synthese.
    Si ce n'est pas possible, il va falloir utiliser des polymérases de compétition pour amplifier une region tres riche en GC.

  35. #29
    Flyingbike

    Re : Clonage

    Un commercial m'avait présenté ça : http://www.clinisciences.com/lire/ar....php?rubid=215

  36. #30
    jmbowie

    Re : Clonage

    Amplifie un fragment plus grand contenant cette séquence (si possible avec des amorces publiées), isole ton grand produit de PCR et fait une PCR nichées avec tes amorces d'intérêt dessus.
    Blast up your life!

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