Clonage

[invitee3e16aec]

Bonjour a toutes et tous
voici mon problème de clonage
L'objectif de ce clonage est de "récupérer" une partie d'un vecteur, pour se faire une amorce foward a été faite pour pouvoir intégrer un nouveau site de restriction, l'amorce reverse elle doit intégrer plusieurs sites, l'insert que l'on doit obtenir doit faire environ 1500-1600bp
le programme classique de PCR ne marchant pas, il a été modifié (étape d'hybridation passé de 52 à 50°C) c'est avec ce changement+ des variations de quantité d'ADN que j'ai réussi a obtenir 1-2 fois un très léger signal (sur gel agarose 1%+BEt), mais depuis plus rien, tout a été testé (augmentation du temps d’élongation, des concentrations en ADN, passage de l'étape d'hybridation a 50 et 45°C durant 2min et température augmentée, TA cloning) je suis donc dans une impasse puisque je n'arrive pas a obtenir cet insert, donc si vous avez des idées je suis preneur! merci
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[invitec718404f]

Salut, quelle est ta matrice d'ADN? Le vecteur? Si oui je ne vois pas pourquoi tu as des souci.

Ta température d'hybridation est faible, quel est le Tm de tes amorces? Peux tu nous donner la séquence de tes amorces pour les checker?

Sinon pour une séquence comme ça si tu n'arrives pas par PCR tu peux la faire synthétiser ça ne te reviendra pas si cher au final.

[invitee3e16aec]

Salut, oui la matrice est bien de l'ADN c'est un vecteur commercial
Pour le Tm la boite qui les a synthétisé donne environ 72°C (par contre je ne peux pas te donner les amorces, car je suis en stage et le sujet est confidentiel).
Je note l'idée de la synthèse qui je pense sera le dernier recours!
merci de ta reponse

[invitec718404f]

Vu ton Tm tu dois prendre un Th autour de 60°C ça sera déjà mieux. Je te conseille une taq haute fidélité hot start.

Sinon ca vient peu être de tes amorces qui font des hairpines ou s'hybrident entre elles mais sans la séquence je peux pas de tire...

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee3e16aec]

Vu ton Tm tu dois prendre un Th autour de 60°C ça sera déjà mieux. Je te conseille une taq haute fidélité hot start.

Sinon ca vient peu être de tes amorces qui font des hairpines ou s'hybrident entre elles mais sans la séquence je peux pas de tire...

Très bien merci de ta reponse (pour info actuellement j'utilise de la PfuII)

[invitec718404f]

De rien! Moi j'aime bien la invitrogen iProof taq, sinon qiagen hot start taq. Est ce que ton problème s'est résolu?

[invite71f23525]

A une température aussi basse d'hybridation, la stringence étant moins forte il peut y avoir une formation de structures secondaires empêchant la PCR, sur les amorces ou sur la matrice. Essayes une température plus haute comme le recommande YouLab, à 60°C, cela peut résoudre ton problème.

[piwi]

Il ne faut pas perdre de vue que la PCR n'a jamais fonctionné. Est-on certain que les amorces ont été bien designées? Une PCR sur vecteur doit fonctionner! Pourquoi avoir choisi un Tm aussi bas? quand vous annoncez 72C, ce sont seulement les parties qui hybrident évidemment. N'est ce pas? Les dNTP sont bons?
Pour les Taq, il n'y a aucun intérêt à utiliser des Taq top moumoutte pour ce genre d'application. Une Taq classique suffit amplement.

Cordialement,
piwi

[invitec718404f]

Oui c'est bizarre que ça n'ait jamais rien amplifié tout de même. Si à 60°C tu n'as toujours rien il va falloir revoir les amorces...

[invitee3e16aec]

Merci de vos reponses
je note le Tm à 60°C pour essayer ça la semaine prochaine!
Pour répondre à Piwi:
oui les amorces ont été vérifiées, donc normalement pas de problème de ce coté!
Le Tm de 72°C est effectivement la température des parties de l'amorce qui s'hybrident
en ce qui concerne les dNTP, je pense qu'ils sont bons, d'autres personnes s'en servent (y compris moi pour d'autres manip) et ça marche
et pour repondre à YouLab: le problème n'a pas été encore resolu (il est a l'arret pour l'instant) car c'est un pont donc.....le labo est vide!!
je vais testé vos hypothèses la semaine prochaine et je vous tiens au courant! merci a tous

[invitec718404f]

Tu n'as pas moyen de faire un témoin positif? Ca m'étonnerai vu que tu fais du clonage mais des fois on a un plasmide similaire qui traîne...

[invitee3e16aec]

Tu n'as pas moyen de faire un témoin positif? Ca m'étonnerai vu que tu fais du clonage mais des fois on a un plasmide similaire qui traîne...

Je ne pense pas que je puisse faire un témoin positif, cependant, l'objectif est de sortir 2 inserts de ce clonage et l'un marche très bien, et l'autre pose de legers problèmes!!

[invitec718404f]

Franchement si ça déconne arrêtez de perdre du temps et faites synthétiser la séquence. Pour 1500pb il y en a pour 500€, c'est vraiment rien! Et en plus vous pourrez vous amuser à mettre sites de restrictions, mutations, etc, ou vous voulez et à votre convenance.

[invitee3e16aec]

effectivement je vais faire le test au Tm 60°C et s'il n'y a (toujours) rien je lancerais l'idée!

[invitec718404f]

Le seul souci ce sont les délais qui sont de 2 à 3 semaines...

[invitee3e16aec]

le délai c'est pas trop un problème, du moment que le resultat est là

[invitec718404f]

Ah bah en faisant séquencer ya pas de souci ta séquence sera bonne... Dans mon labo certains n'étaient pas fan de la méthode car trouvaient ça trop cher mais au final quand tu met bout à bout toute's les dépenses plus le temps passé tu te rends compte que c'est TRES rentable!

[invitee3e16aec]

merci de ton aide!

[invitec718404f]

De rien! Bon courage pour tes manips!

[invitee3e16aec]

Bon et bien la PCR a Tm 60°C n'a rien donné..... :'-(
j'ai lancé ce soir une PCR avec différentes concentrations en Mg2+ et Cl- on verra ce que ça donne demain!

[invitec718404f]

Bon bah moi je parie sur un souci d'amorces!

[invitee3e16aec]

lol je te tiendrais au courant si un jour ça marche!!

[invitec718404f]

OK, bon courage en tout cas! Pas facile les manips quand ça ne va pas aussi bien que sur le papier...

[invitee3e16aec]

Bon et bien idem rien! la commande de gène synthétique est faite!

[invitec718404f]

Vous avez commandé ça chez qui?

[invitee3e16aec]

hahaha! revirement de situation! la séquence ne peut pas etre synthétisée à cause de longue portion de G/C qui rende la synthèse impossible.....j'ai fait hier une PCR avec 5% de DMSO et une première étape de PCR a 94°C durant 3min puis en cycle (94°C 45 sec, un gradient pour la temperature du Tm de 50 à 70°C, et l'elongation)-->suspense! rien!! Si vous avez de nouvelles idées avec ces nouvelles infos je suis preneur!!!
merci

[invitec718404f]

En ayant la séquence ça serait plus facile... A mon avis tu as des structures II qui empêchent l'hybridation de tes amorces.

[invitec0b62935]

hahaha! revirement de situation! la séquence ne peut pas etre synthétisée à cause de longue portion de G/C qui rende la synthèse impossible.....j'ai fait hier une PCR avec 5% de DMSO et une première étape de PCR a 94°C durant 3min puis en cycle (94°C 45 sec, un gradient pour la temperature du Tm de 50 à 70°C, et l'elongation)-->suspense! rien!! Si vous avez de nouvelles idées avec ces nouvelles infos je suis preneur!!!
merci

Dans le cas ou ton insert code pour une protéine, il n'y a pas moyen de faire de l'optimisation de codon pour arriver a un taux de GC plus raisonnable ? Ca faciliterait la synthese.
Si ce n'est pas possible, il va falloir utiliser des polymérases de compétition pour amplifier une region tres riche en GC.

[Flyingbike]

Un commercial m'avait présenté ça : http://www.clinisciences.com/lire/ar....php?rubid=215

[invitee863e61a]

Amplifie un fragment plus grand contenant cette séquence (si possible avec des amorces publiées), isole ton grand produit de PCR et fait une PCR nichées avec tes amorces d'intérêt dessus.