Clonage

[invitec718404f]

Oui l'optimisation est une bonne idée. Demandes chez eurogentec, custom genes, ils te le font gratuitement.
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[invitee3e16aec]

Merci pour vos reponses, en fait la sequence contient des promoteurs des terminateurs que je souhaite recuperer (impossible d'elargir car il y a des genes sur les cotés que je ne veux pas) et au milieu un MCS bien sur
donc l'objectif etait de faire une amorce sens "a gauche" en inserant un site de restriction une amorce qui est vers le MCS mais là elle permet d'apporter 2 sites de restrictions et de l'autre coté faire une amorce sens "a droite" en inserant un site unique (les deux inserts ont donc a leurs extremités un site unie et au milieu au refait un MCS) et de meme son amorce complémentaire est vers le MCS et permet d'inserer 2 nouveaux sites de restrictions
je vous met demain la sequence (une partie car je vais devoir en cacher certain morceaux a cause de la confidentialité) peut etre que ça vous donnera une meilleure vision des choses qui est un peu abstraite avec des phrases (j’essaierai de vous mettre aussi un schema de l'objectif pour que ce soit plus clairs)
en tout cas merci bien!

[invitec718404f]

Je ne vois pas pourquoi tu ne pourrais pas élargir. Il suffit d'insérer des sites de restriction et après tu coupes.

[invitee3e16aec]

Je ne vois pas pourquoi tu ne pourrais pas élargir. Il suffit d'insérer des sites de restriction et après tu coupes.

Tout simplement car il n'y a aucuns sites de restrictions (qui puissent convenir) aux alentours....les deux sites de restrictions que j'ai besoin de placer aux extremités servent a isoler les cassettes que j'ai besoin de recuperer si je m'ecarte je vais amplifier au passage donc des parties que je n'ai pas besoin et qu'il me sera dur d'enlever apres

[invitec718404f]

Et bien tu les insères toi même les sites.

[invitee3e16aec]

Et bien tu les insères toi même les sites.

je suis bien d'accord, mais ces sites vont etre au niveau des morceaux de genes aux extremités que je ne veux pas donc certes apres restrictions ils seront amputés et donc pas fonctionnel mais il y aura toujours des morceaux donc c'est pas très propre, les deux sites uniques que j'ai mis juste pour cadrer la sequences que je veux ont ce role, d'eviter d'avoir les parties aux exterieurs

[invitec718404f]

Et oui c'est vrai XD

[invitee863e61a]

Tout simplement car il n'y a aucuns sites de restrictions (qui puissent convenir) aux alentours....les deux sites de restrictions que j'ai besoin de placer aux extremités servent a isoler les cassettes que j'ai besoin de recuperer si je m'ecarte je vais amplifier au passage donc des parties que je n'ai pas besoin et qu'il me sera dur d'enlever apres

Ben tu élargis pour une 1ère PCR ensuite tu fais une seconde PCR sur ce 1er produit. L'avantage c'est que tu amplifies ta zone d'intérêt sans avoir les contraintes de sa séquences (tu parlais d'une haute teneur en GC par exemple).

[invitec718404f]

On revient au problème précédent au final...

[invitee3e16aec]

Ben tu élargis pour une 1ère PCR ensuite tu fais une seconde PCR sur ce 1er produit. L'avantage c'est que tu amplifies ta zone d'intérêt sans avoir les contraintes de sa séquences (tu parlais d'une haute teneur en GC par exemple).

je met demain la sequences tu verras mieux (il y a en fait 2 seq riches en GC, une est dans un promoteur....et l'autre entre je sais plus quoi, mais du coups ces 2 sequences sont en plein milieux de l'insert que je n'arrive pas a obtenir)

[invitee863e61a]

je met demain la sequences tu verras mieux (il y a en fait 2 seq riches en GC, une est dans un promoteur....et l'autre entre je sais plus quoi, mais du coups ces 2 sequences sont en plein milieux de l'insert que je n'arrive pas a obtenir)

J'ai pas tout tout lu mais si le problème n'est que lié au % de GC tu peux aussi utiliser des dNTP enrichis en G/C

[invitec718404f]

C'est surtout pour l'hybridation et l'élongation que c'est embêtant.

[invite71f23525]

Dommage que tu ne puisses pas nous mettre ta séquence, peut-être que tes séquences riches en GC forment un hairpin qui fait sauter la polymérase lors de la PCR. Pour le DMSO, tu n'as peut-être pas assez pousser la concentration. Dans cette discussion ou une autre, Yoyo conseillais 10% DMSO, et autre chose dont j'ai oublié le nom, tu devrais peut-être essayer cela. J'essaye de retrouver son post.

Edit : j'ai retrouvé le message de Yoyo

sinon tu peux essayer de rajouter du DMSO (10%) et de la bétaïne.
Visiblement pour les PCR qui ont du mal a donner de bons rendements, ca améliore bien le resultat!

[invitee863e61a]

Quelle quantité de matrice tu utilises ? Un excès peut radicalement inhiber une PCR aussi .

[invitee3e16aec]

Quelle quantité de matrice tu utilises ? Un excès peut radicalement inhiber une PCR aussi .

j'ai testé 25/50/75/100/200/400ng sans resultats donc pas defaut j'utilise 50ng