RACE-PCR: besoin d'explications

[invitedcfa2657]

Bonjour,

J'écume en long et en large le web pour comprendre la technique de RACE-PCR; a vrai dire, on nous a lâché au cours avec un schéma (http://thunder.biosci.umbc.edu/class...s/race%202.jpg) mais je n'arrive pas à comprendre:

- le but de la manipulation: D'après ce que j'ai compris, ce serait pour pouvoir placer les amorces lors d'une PCR. Il faut connaitre deux endroits pour placer les amorces. On connait le début et donc on cherche à déterminer la fin. Ou inversement suivant que c'est une RACE-PCR 5' ou 3'. Juste ?
- comment on réalise la manipulation ?

Merci d'avance
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[Edelweiss68]

Bonjour,

Avez-vous lu cette discussion ? => http://forums.futura-sciences.com/bi...-race-pcr.html

Et commencé par là ?

[invitedcfa2657]

Bonsoir,

Oui j'avais bien lu ce sujet + la page wiki au préalable, mais cela ne m'aidait pas :/ J'ai néanmoins fini par comprendre, une étudiante de ma section m'a expliqué ^^

Merci

[Edelweiss68]

Oui j'avais bien lu ce sujet + la page wiki au préalable, mais cela ne m'aidait pas :/ J'ai néanmoins fini par comprendre, une étudiante de ma section m'a expliqué ^^

Tant mieux !

Si vous en avez le temps, ce serait sympa de faire partager votre explication, ça pourra éventuellement servir à d'autres étudiants en détresse.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitedcfa2657]

Ok, voici (en espérant que ca soit vraiment bon, sinon c'est un peu .. )



A partir de l'ARNm de départ :
- on ajoute une séquence amorce oligoT complémentaire à la queue polyA de l'ARNm
- à cette séquence oligoT est ajoutée postérieurement une séquence connue
- ensuite la RT fait son travail de polymérisation à partir de l'oligoT
- Dénaturation pour n'avoir qu'un brin ADNc
- Ajout d'une amorce bien en amont de la fin de l'ARN (la fin étant la partie juste avant la queue polyA, on cherche à la connaitre)
- ADN polymérase polymérise de cette façon toute la fin de "ARN" qui est en fait maintenant de l'ADNc. Elle polymérise aussi la séquence complémentaire à la séquence oligoT et la séquence connue.

Ensuite on va prendre le 2e ADNc synthétisé (le dernier produit) et le séquencer pour connaitre la séquence en rouge, séquence qui contient la fin de l'ARNm (codon stop et tout). Vu qu'on connait le début (via l'amorce n°2) et la fin avec l'oligoT et la séquence connue, si on passe au séquenceur, tout ce qui sera entre les deux ca sera la séquence de fin d'arn qui était pas connue et qu'on connaitra à ce moment là.

Correct ?

[invite71f23525]

Quelques points à rectifier/compléter, sinon les étudiants en détresse sur la 5'-RACE seront mal barrés!

- à cette séquence oligoT est ajoutée postérieurement une séquence connue

Quel intérêt?

Normalement, une fois qu'on a placé en 5' de l'ADNc une séquence connue, pas besoin d'ajouter ultérieurement une séquence connu en 5' du polyT. Cela se fait au début : pour la reverse-transcription, on prend une amorce polyT à laquelle on ajoute en 5' une courte séquence riche en GC. Cela permet de stabiliser l'extrémité.

- Ajout d'une amorce bien en amont de la fin de l'ARN

PLus que "bien en amont", l'amorce est carrément placée à l'extrémité 5'. Mais comment choisis-tu l'amorce en question sachant que tu ne connais pas l'extrémité 5'? Il va falloir que tu ajoutes une séquence connue à l'extrémité 5', et c'est certainement l'étape la plus importante de la 5'-RACE. Les autres étapes c'est du bricolage classique. As-tu une idée de la façon de procéder?

Tu as oublier l'étape à la RNase H qui permet de dégrader l'ARN une fois la reverse-transcription effectuée.

[invitedcfa2657]

En fait la séquence connue est sûrement la séquence de gc stabilisante dont vous parlez ^^

Non aucune idée pour la deuxième amorce, nous avons juste vu que nous connaissons cette séquence a l'autre extrême (codon start?)

Quant à la rnase, elle est dans le tiret "dénaturation"

merci a vous, maintenant direction l'examen ^^

[invitedcfa2657]

J'ajoute quelques corrections à ce que j'ai dit ce matin dans l'empressement.

La deuxième amorce en fait c'est parce qu'on part d'une situation où on connait le début de l'ARN (comment, bonne question) mais pas la fin, du coup on peut mettre la 2e amorce sans problèmes. Donc pas de codon start vu que ce codon on va surement pas le retrouver qu'une seule fois, ça n'irait pas ^^

Dans le tiret dénaturation, c'est RNAse ou NaOH, selon la méthode qu'on veut utiliser.

Voilà

[invitedcfa2657]

(j'explique dans un cas où c'est une 3'RACE)

[invite71f23525]

La 3'-RACE c'est la plus facile car on sait qu'en 3' il y a le polyA. On peut donc amplifier cette région sans se soucier de la partie codante. En revanche, pour amplifier la partie 5' qu'on ne connait pas, afin d'éviter de perdre l'extrémité 5', il faut coller une séquence connue en 5' pour pouvoir amplifier. Plusieurs méthodes existent, elles s'appliquent toutes juste après la reverse-transcription, lorsqu'on a un hybride ARN-ADNc.

- On peut faire agir une terminal transférase avec du dCTP (ou du dGTP) par souci de stabilité des extrémités. Ainsi, cette enzyme va ajouter des bases en 3' de l'ADNc néosynthétisé. Il ne restera plus qu'à prendre un oligo-dG pour pouvoir amplifier la partie 5' codante.
- On peut liguer un oligonucléotide de séquence connue (idéalement possédant un site de restriction) avec la T4 DNA ligase en 3' de l'ADNc néosynthétisé. On aura plus qu'à prendre un oligo complémentaire pour amplifier la région 5' codante.
- On peut circulariser l'ADNc néosynthétisé après destruction de l'ARN à la soude (ou incubation longue avec RNase), on fait agir une T4 RNA ligase. Ainsi, une fois l'ADNc simple brin circularisé, il est aisé de l'amplifier et avoir la séquence intégrale.
- D'autres méthodes existent, les seules limites sont la faisabilité et l'imagination.

Un point qui semble obscur pour toi :

nous avons juste vu que nous connaissons cette séquence a l'autre extrême (codon start?)

Alors déjà, faire une amorce à partir d'un seul codon c'est léger pour faire une PCR (3 bases, ce n'est pas assez). D'autre part, sur un ARNm, il y a une partie 5'-UTR qui précède le codon d'initiation. Le codon d'initiation n'est donc pas au début de l'ARNm. Commencer au niveau de ce point revient à perdre tout de qu'il y a en amont. Maintenant que je t'ai donné les méthodes pour récupérer même la toute première base en 5', tu peux récupérer aisément la partie 5'-UTR.

[invitedcfa2657]

Oui c'est après coup pendant l'examen que je me suis rendu compte de l'idiotie du codon start avec amorce ^^ c'était pas en rapport avec la question à laquelle je répondais mais j'ai tilté ^^

D'où ma précision dans le message suivant

En ce qui concerne le collage de séquence connue en 5', nous avons vu en effet la terminal transférase mais avec du dATP (comme nous nous basions sur l'image dont j'ai mis le lien dans le premier message). Après comme vous dites, avec du dCTP ou dGTP c'est mieux pour la stabilité ^^

Merci de votre aide en tout cas