Gros problème de HEK

[invitea74316c7]

Bonjour,
Suite à des problèmes de contamination avec mes cellules HEK, j'en ai commandées des nouveau en UK, à savoir des HEK ECACC. Malheureusement ces cellules se portent très mal et je souhaiterai savoir si selon vous j'ai effectué une mauvaise manoeuvre:
Après réception des cellules qui étaient parfaitement congelées et sous glace, je les ai rapidement décongelées puis placée dans 5ml de milieu préchauffé, j'ai centrifué à 150g durant 5 min puis resuspendu dans 5 ml de milieu que j'ai mis dans une flasque et laissé en culture. Après 24h j'ai pu remarquer que proche de 95% des cellules n'étaient pas attaché à la boite mais flottait avec énormément de débris. Après un changement de milieu il ne reste que très peu de cellules et elles sont en mauvais état.
J'ai déja travaillé avec ces cellules a de nombreuses reprises et normalement elles adherent en seulement quelques heures. Par conséquent je ne vois vraiment pas où peut se trouver le problème! Qu'en pensez vous?

Merci d'avance
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[invite71f23525]

Quelle est la taille de la flasque que tu as utilisé pour décongeler les cellules? Généralement, plus c'est une petite flasque, mieux c'est car la densité cellulaire est augmentée ce qui favorise la reprise des cellules. Quelle est la concentration en sérum de ton milieu?

Pour la procédure que tu as utilisé, je ne vois rien à redire. Fréquemment, une décongélation qui ne marche pas témoigne d'une congélation ratée. En effet c'est cette dernière qui est la plus critique pour la survie des cellules.

[invitea74316c7]

Salut LXR, merci de ta réponse.
J'ai utilisé les plus petites flasques que je possède, à savoir des T25 donc de 25cm2 de surface. Après un démarrage très très long les cellules commencent enfin à adhérer et je pense que cela devrait fonctionner. Malheureusement j'ai du procéder à un changement de milieu et même en faisant très attention j'ai perdu pas mal de cellules, néanmoins les cellules restantes sont en train de former une bonne colonie!
Pour le problème de congélation ces cellules viennent tout droit du fabricant donc j'ose espérer que tout a fonctionner correctement chez eux !

La teneur en sérum du milieu est de 10%