Gateway technologies

[inviteb4e69e1e]

Bonjour,

J'ai un petit souci de compréhension au niveau des technologies gate way (cf. image en attaché)

Déjà, le "By-product" de l'image, est chez moi appelé "donor vector". A-t'il une utilité quelconque ou est-ce qu'on ne peux rien en faire?

Dans le même ordre d'idée, eais làn utilisant de la BP clonase plutôt que de la LR clonase, on peux faire la réaction inverse, mais là encore, je vois pas très bien l'intérêt. C'est juste pour avoir notre fragment d'intérêt sur un vecteur avec une résistance à la Kanamicine plutôt qu'à l'Ampicilline?

Cordialement,

Astro

Source de l'image: bioresearchonline.com
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[invite6d6b7805]

Hey,

Je vais essayer d'expliquer.

Pour commencer tu réalise une première recombibaison avec ton entry vector et ton fragment d'ADN d'intérêt flanqué des attb1/2.

Le résultat sera ton byproduct ou Donnor vector, qui contient ton gène d'intérêt.
Le truc est que ceci te permet après par la LR réaction de placer ce gène dans n'importe quel vecteur GW compatible.

Donc 1:
TU places ton fragment dans l'entry clone et tu étale ça sur LB-kanamycin. La réaction provoque l'xcision du gène ccdb, léthal pour tes bactéries, donc les colonies que tu vois pousser ont forcément eu le ccdb excisé, donc ton ADN à la place ---> Proficiat !

Ensuite, tu recombine ton Donnor vector avec ton expression vector qui lui porte un ampicilline resistant gene, et de plus la cassette gateway contient un gene ccdb excisé lors de la LR. Ce qui permet en faisant pousser ça sur un milieu avec ampicillin de ne conserver en théorie que la bonne construction.

D'où l'intérêt de la sélection successive kanamycin ampicilline, ça t'évite de te retrouver à la fin avec des colonies portant ton Donnor vector, dont tu te fiches après la LR.

Pense aussi à séquencer ton Donnor vector, expression vector si tu n'es pas sûr, et la construction finale