Clonage

[invite15af1aaf]

Bonjour,

J'ai besoin d'aide pour un clonage. Je dois cloner un fragment d'ADN génomique bactérien dans un plasmide. La stratégie choisie est de linéariser le vecteur par digestion enzymatique , de le purifier sur gel, de le déphosphoryler et de faire la ligation avec l'insert. N'ayant pas de marqueur de sélection pour mes plasmides recombinants, je dois m'assurer d'une bonne linéarisation et déphosphorylation de mon plasmide pour éviter d'avoir des plasmides natifs. Donc, pour m'assurer dans un premier temps de la bonne linéarisation, je transforme avec le plasmide linéarisé. Et je bloque à cette étape: j'obtiens autant de clones pour mes bactéries transformées par le vecteur linéarisé que par celles transformées par le plasmide natif. J'en ai donc déduit une mauvaise digestion. Or, j'utilise les enzymes Fast Digest de chez Fermentas pour une digestion o/n.

Avez-vous une idée ou des suggestions pour résoudre ce problème? Merci d'avance
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[ratafouin]

Bonjour.
Tu peux toujours tester tes enzymes avec un plasmide possédant un insert.
Si l'insert sort bien avec cette enzyme elle devrait être ok.

Quand tu fais une transformation seule une petite partie des bactérie de départ prennent un plasmide.
Si tu fais une transformation avec 100ng de plasmide tu peux avoir beaucoup de transformants. Alors si tu peux 1micro gramme de plasmide que tu digères, s'il reste même moins de 10% de plasmide non digéré tu vas avoir des soucis lors de ta transfo.

Si tu peux fais des doubles digestions avec des enzymes n'ayant pas d'extrémité compatible pour éviter que ton plasmide ne se re-ligue sur lui même (Si possible biensure)

[invite02cefc91]

Bonjour,

J'imagine que tu dessines tes amorces en incluant les sites de restriction. Rajoutes-tu des nucléotides supplémentaires sur ces primers ? (les sites de restriction aiment bien être entourés pour une bonne digestion)

Comment fais tu ta digestion ? En rajoutant toute la quantité d'enzyme d'un coup ? Moi, je diminue la quantité d'enzyme par deux et j'en rajoute à la moitié du temps de digestion pour diminuer "son essoufflement" ..

Autre astuce, après tout dépend de ta ligase, mais la mienne est conseillé de la faire marcher à 16°C O.N. mais ca marche bien mieux à 4°C ...