bonsoir a tous, j'ai un exercice a faire concernant la production d'une proteine de fusion, GFP-GST.
j'ai comme vecteur pGEX-4T-2 (lien ci dessous)
http://www.google.fr/imgres?q=pGEX-4...:429,r:5,s:117
et le vecteur pEGFP-N1
http://www.google.fr/imgres?q=pEGFP-...1t:429,r:5,s:0
j'ai donc utilisé les enzymes de restriction coupant au niveau du sites EcoRI de pGEX. afin d'inserer mon gène EGFP qui possède dans sa partie MCS, un site de restriction EcoRI egalement. mais je ne sais pas comment couper, apres le gène EGFP pour qu'il soit complementaire de la sequence de l'extremité colante correspondante sur pGEX.
dans mon énoncé, je dispose d'amorce, et je ne sais pas si je dois les utiliser. de plus je n'ai pas compris comment cela fonctionne.
amorce GFP5: TAGCGCTACCGGACTCAGAT position 593-613 dans pEGFP-N1
amorce GFP3: CAAATGTGGTATGGCTGATTATG position 1440-1417 dans pEGFP-N1
amorce PGEX5: GCTGGCAAGCCACGTTTGGTG position 869-891 dans pGEX-2T
amorce pGEX3: GGAGCTGCATGTGTCAGAGG position 1042-1020 dans pGEX-2T
doit on utiliser les amorces ou doit ont couper tout simplement pEGFP-N1 a Not 1 ou XBA1 situé quelque nucleotide apres EGFP. sachant que il existe un site de restriction Not1 sur pGEX-4T-2 ?
merci de bien vouloir m’éclairer
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