plasmide recombinant et ADN ligase

[invitef5c51008]

bonjour,
j'ai un TP de digestion enzymatique et je suis bloquée sur une question concernant la circularisation d'un fragment d'un plasmide (ce dernier a été hydrolysé par l'enzyme de restriction Agel,ensuite incubé avec la klénow en présence de 4 dNTP , ensuite digéré par EcoRV puis son plus grand fragment contenant 2 sites BglII est purifié).

ma question est : avec quel enzyme peut-on favoriser la circularisation et dans quelle condition ? Je suppose quu'on utilise l'ADN ligase mais dans quelle condition j'en ai aucune idée.

On me demande également de schematiser ce plasmide en indiquant la localisation des liaisons formée.

Comment savoir si le plasmide est un substrat d'un enzyme ?

Merci de pouvoir me répondre
Bonne journée à vous tous
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[invite563835f6]

Alors si j'ai bien compris:
- ta première digestion permet de linéariser ton plasmide au niveau d'un site AgeI
- ensuite tu incubes avec klenow et des dNTP afin d'obtenir des bouts complets (AgeI ne fait pas une coupe franche)
- tu coupes avec EcoRV qui fait une coupe franche. Tu obtiens donc deux fragments linéarisés, et tu gardes le plus grand, qui contient tes sites BglII.

Ta problématique est:
comment recirculariser ton gros fragment pour former un nouveau plasmide. D'un côté tu as une partie du site de restriction AgeI, et de l'autre tu as une partie du site de restriction de EcoRV. Tes bouts sont entiers... (tu n'as pas de "sticky ends") Alors, quelle enzyme catalyse la ligation de deux fragments d'ADN ?
Enfin, tu veux que ton fragment se recircularise, c'est à dire que l'un de ses bouts se lie avec son autre bout... Autrement dit, tu veux favoriser une réaction intramoléculaire. Dans quelle condition cela est favorisé ? Il faut que tu choisisses une concentration optimale en ADN: élevée ou faible ?

Bonne chance

[invitef5c51008]

oui oui oui c'est exactement ça!!!!!
je suis bloquée depuis hier, j'ai cherché partout sur google, wikipédia mais pas encore trouvé une réponse qui me convient
et demain c'est exam
quelqu'un peut m'aider please !!!!! Merciiiii !!!

[invite563835f6]

As tu essayé de réfléchir aux premiers éléments de réponse que je t'ai apportés ?

Tu cherches une enzyme qui permet la ligation de deux bruns d'ADN.
Tu cherches une concentration idéale en ADN qui permet une réaction intramoléculaire.
Je pense que tu peux trouver ces réponses par toi-même. Alors ?

[A voir en vidéo sur Futura]