Plasmide recombinant

[invite81474f79]

salut , il y a un truc que je comprend pas: pourquoi on utilise une double sélection tétracycline et ampicilline pour sélectionner un plasmide recombinant.
Alors si quelqu'un pourrai m'expliquer ça serai gentil...
Merci d'avance
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[piwi]

Si j'ai bien compris où tu voulais en venir je vais tacher d'expliquer ce qui se fait classiquement.
En fait, dans le plasmide, on place souvent un premier gene de resistance à un antibiotique dans la région de recombinaison. Ceci pour pouvoir selectionner les vecteurs recombinants. Faciel et instinctif je dirais...

Ensuite on place un gène de sensibilité à un antibiotique en dehors de la cassette de clonage.
On selectionne deja sur la résistance les cellules portant le plasmide. On a donc dans le lot des cellules qui portent le plasmide et des cellules qui ont recombiné. Ce que l'on veut maintenant c'est n'avoir plus que les cellules qui ont recombinées. Du coup on va les tester avec le gène de sensibilité à l'antibiotique. Si le gène est encore sur le plasmide, elles sont sensibles et meurent. Si il est recombiné, les cellules ne sont pas sensibles à l'antibiotique et résistent.

Voilà vite fait le principe de la chose.

Bye,
piwi

[invite81474f79]

a ok merci beuacoup pour ta réponse

[inviteacc0e9c9]

L'ampicilline est l'antibio classique qui permet de sélectioner les bactéries qui contiennent le plasmide quand tu les transformes (seuls poussent les bactos qui ont le plasmide). C'est l'étape de la contruction et de la sélection.
L'autre antibiotique permet la sélection dans un autre type de cellule (une culture cellulaire ou primaire). C'est l'étape de l'analyse, de l'essai biologique: par exemple quel sera l'effet du plasmide sur les cellules humaines.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite81474f79]

ok je comprend mieux merci pour vos aides

[invitef0b1d72b]

j'allais t'écrire une réponse mais je vois que piwi t'a déjà répondu.

[invite2cd4b344]

Bjr
l'utilisation d'une double sélection Tet et Amp c.a.d 2 marqueurs de sélection permet une selection directe des plasmides recombinants.
Quand un fragment d'ADN est inséré ds la région codante pr la résistance à l'Amp les transformants croissent toujours en présence de la Tet, mais non plus en présence d'Amp.
cette sélection s'effectue en étalant les bactéries transféctées sur une boite d'agar contenant la Tet, toutes les colonies obtenues de cette façon contiennent un plasmide.ces colonies résistantes sont ensuites téstées pr leur capacité de croitre sur un milieu contenent l'Amp. ce criblage distingue les cellules qui contiennent un plasmide lui meme(croissance) et celles qui contiennent un plasmide recombinant(pas de croissance).

[invitef798c617]

salut , il y a un truc que je comprend pas: pourquoi on utilise une double sélection tétracycline et ampicilline pour sélectionner un plasmide recombinant.
Alors si quelqu'un pourrai m'expliquer ça serai gentil...
Merci d'avance

bonsoir,
c'est très utile d'avoir 2 marqueurs (ex: Tet/Amp) quand tu fais un clonage dans lequel ton fragment provient d'un autre plasmide donneur (ex: Amp),
bien souvent ce plasmide donneur génère un bruit de fond de transformation qui peut donner pas mal de cfu sur Amp,
par contre si tu sélectionnes sur Amp+Tet (ou Tet seul) ce bruit de fond va disparaitre ce qui améliore le rendement du screening,
c'est parfois la petite différence entre un clonage qui marche et celui qui rate!
Hiro

[invite3246ce7d]

Est-ce que qu'elqu'un pourrait m'expliquer comment on fait pour savoir si un plasmide recombiant ou non recombiant est sensible ou résistant à aux antibiotiques. C'est ma première année en fac de bio et pour tout ça je suis un peu perdue...

[invite17a570c1]

Salut et bienvenue

Est-ce que qu'elqu'un pourrait m'expliquer comment on fait pour savoir si un plasmide recombiant ou non recombiant est sensible ou résistant à aux antibiotiques. C'est ma première année en fac de bio et pour tout ça je suis un peu perdue...

Est-ce que tu pourrais préciser ta question? L'explication de Piwi est très claire


Cordialement,