Plasmide recombinant

[inviteec1705dd]

Bonjour,

Est ce que quelqu'un pourait me dire si ceci est correct? :

1) les plasmides peuvent être utilisées pour faire produire une protéine d'intérêt à une cellule "hôte"

2) le plasmide possède systématiquement un gène de sélection (pour vérifier la présence du plasmide) ainsi qu'un gène "phénotypique" - dit gène raporteur- pour verifier la présence de la séquence d'intérêt dans le vecteur plasmidique.

3) Tous les plasmides sont d'abord multipliés dans E.coli avant d'être multiplié ailleurs (bacilles, levures, mammifères)

4) Tous les plasmides possèdent donc un promoteur, une séquence de terminaison ainsi q'une séquence de liaison au ribosomes, un codon START et STOP pour chaque gène (même pour les gènes de résistance)

5) Pour les bactéries, on peut ajouter une séquence "Flag" ou etiquette dans le plasmide afin de permettre une extraction plus facile de la protéine, on peut également ajouter un gène (Ompa) permettant l'excrétion dans le périplasme.
Pour les levures, les protéines sont d'office excrétées dans le milieu extracellulaire (???)
Pour les cellules de mammifères, on peut également ajouter le "Flag" ainsi qu'une séquence signal d'excretion, permettant donc l'exportation de la protéine dans le milieu extracellulaire.

6) On doit tenir compte de séquences introns (tel UTR5') nécessaire pour la régulation lorsqu'on produit une protéine dans une cellulemammifères. Ces séquences doivent elles aussi être prises en compte pour les levures et bactéries? Les séquence de régulation EUC seront elles donc prises en compte chez le PROCARYOTES?

7) Lors de l'utilisation d'agrobacterium tuméfaciens, on crée un plasmide contenant un gène de résistance pour E.Coli et pour la plante, une origine de réplication E.Coli, une origine pour Agrobacterium, et puis deux séquence "front gauche et front droit" dans lequel on retrouve le gène d'intérêt ainsi qu'un gène de sélection pour la plante.

Voilà, je pense que c'est tout, merci de me donner votre avis sur ces quelques phrases
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[inviteec1705dd]

Lol... personne ne se lance ??

Allez c'est pas si monstrueux que ça quand même?

Bon, j'espère que quelqu'un me donnera son avis car l'exam c'est demain

... et j'ai une peur bleue

[invite186e1b0b]

salut! sans vouloir être pénible, tu en penses quoi des ces affirmations?

Je pense (comme pas mal de monde sur le forum) que ce serait plus constructif dans ce sens là !


Amicalement,

Greg

[inviteec1705dd]

Si j'étais si sure de moi je ne me casserais pas la tête a vous demander ce que vous en pensez

Mais bon, si apparament ça vous ennui tous ......

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee863e61a]

Bonjour,

Est ce que quelqu'un pourait me dire si ceci est correct? :

1) les plasmides peuvent être utilisées pour faire produire une protéine d'intérêt à une cellule "hôte"

On parle de plasmide de production/ d'expression...


2) le plasmide possède systématiquement un gène de sélection (pour vérifier la présence du plasmide) ainsi qu'un gène "phénotypique" - dit gène raporteur- pour verifier la présence de la séquence d'intérêt dans le vecteur plasmidique.

Le marqueur de sélection suffit. Pas besoin de gène "phénotypique" pour vérifier la présence de l'insert (tu penses à lacZ pour bleu/blanc je suppose) car il existe d'autres moyens pour cela (digestions, PCR, etc.)

3) Tous les plasmides sont d'abord multipliés dans E.coli avant d'être multiplié ailleurs (bacilles, levures, mammifères)
Il existe des vecteurs de clonages dessinés pour des hôtes eucaryotes.

4) Tous les plasmides possèdent donc un promoteur, une séquence de terminaison ainsi q'une séquence de liaison au ribosomes, un codon START et STOP pour chaque gène (même pour les gènes de résistance)

5) Pour les bactéries, on peut ajouter une séquence "Flag" ou etiquette dans le plasmide afin de permettre une extraction plus facile de la protéine, on peut également ajouter un gène (Ompa) permettant l'excrétion dans le périplasme.
Pour les levures, les protéines sont d'office excrétées dans le milieu extracellulaire (???)
Pour les cellules de mammifères, on peut également ajouter le "Flag" ainsi qu'une séquence signal d'excretion, permettant donc l'exportation de la protéine dans le milieu extracellulaire.

6) On doit tenir compte de séquences introns (tel UTR5') nécessaire pour la régulation lorsqu'on produit une protéine dans une cellulemammifères. Ces séquences doivent elles aussi être prises en compte pour les levures et bactéries? Les séquence de régulation EUC seront elles donc prises en compte chez le PROCARYOTES?

7) Lors de l'utilisation d'agrobacterium tuméfaciens, on crée un plasmide contenant un gène de résistance pour E.Coli et pour la plante, une origine de réplication E.Coli, une origine pour Agrobacterium, et puis deux séquence "front gauche et front droit" dans lequel on retrouve le gène d'intérêt ainsi qu'un gène de sélection pour la plante.

Voilà, je pense que c'est tout, merci de me donner votre avis sur ces quelques phrases

N'oublie pas de donner ton avis aussi (après avoir relu ton cours)

[inviteec1705dd]

Ce que j'ai noté c'est ce qui me semble correct

Donc voilà, et vous, vous en pensez quoi?????

[invite186e1b0b]

Salut!
1. oui
2. Je dirais non, sans être 100% sûr, ca date un peu tt ca!
3. non
4.Je dirais faux, ca dépend de l'organisme dans lequel il est utilisé.
5. Ben dans les levures, pour que tes prots se retrouvent dans le milieu Extra cellulaire, il faut que tout cela soit produit dans le ER.

bon je réponds pas à tout, mais c'est loin tout cela et je ne veux pas t'induire en erreur!

amicalement,

Greg

[invite17a570c1]

1) les plasmides peuvent être utilisées pour faire produire une protéine d'intérêt à une cellule "hôte"

Comme Squalor, je dis oui.

2) le plasmide possède systématiquement un gène de sélection (pour vérifier la présence du plasmide) ainsi qu'un gène "phénotypique" - dit gène raporteur- pour verifier la présence de la séquence d'intérêt dans le vecteur plasmidique.

Systématiquement les deux? A quoi sert le gène de résistance et à quoi sert le gène rapporteur? Précisément, pas comme dans ta question

3) Tous les plasmides sont d'abord multipliés dans E.coli avant d'être multiplié ailleurs (bacilles, levures, mammifères)

Je ne dirais pas oui à cette affirmation...

4) Tous les plasmides possèdent donc un promoteur, une séquence de terminaison ainsi q'une séquence de liaison au ribosomes, un codon START et STOP pour chaque gène (même pour les gènes de résistance)

Mais ils les possèdent d'eux-mêmes ou ils les possèdent parce qu'on veut les introduire quelque part? Un plasmide qui ne porte pas de gène d'intérêt possède ces éléments ou pas?

5) Pour les bactéries, on peut ajouter une séquence "Flag" ou etiquette dans le plasmide afin de permettre une extraction plus facile de la protéine, on peut également ajouter un gène (Ompa) permettant l'excrétion dans le périplasme.
Pour les levures, les protéines sont d'office excrétées dans le milieu extracellulaire (???)
Pour les cellules de mammifères, on peut également ajouter le "Flag" ainsi qu'une séquence signal d'excretion, permettant donc l'exportation de la protéine dans le milieu extracellulaire.

La séquence tag ou flag peut être ajoutée, oui. C'est par exemple le principe de la GST pull down.
Ensuite, en ce qui concerne les histoires de milieu extracellulaire, je n'en sais strictement rien, on ne nous en a jamais parlé en fac...

6) On doit tenir compte de séquences introns (tel UTR5') nécessaire pour la régulation lorsqu'on produit une protéine dans une cellulemammifères. Ces séquences doivent elles aussi être prises en compte pour les levures et bactéries? Les séquence de régulation EUC seront elles donc prises en compte chez le PROCARYOTES?

Une 5'UTR est pour toi un intron?
Ensuite, je dirais que les séquences de régulation eucaryotes ne sont pas prises en compte par les bactos. De même, lorsque nous avons fait de la GST pull down avec un gène de la truite arc-en-ciel, on n'a pas pris en compte les séquences régulatrices du gène lui-même car il était fusionné avec le début de celui de la GST. Enfin, je suis vraiment rouillée en ce qui concerne les Eucaryotes, désolée.

7) Lors de l'utilisation d'agrobacterium tuméfaciens, on crée un plasmide contenant un gène de résistance pour E.Coli et pour la plante, une origine de réplication E.Coli, une origine pour Agrobacterium, et puis deux séquence "front gauche et front droit" dans lequel on retrouve le gène d'intérêt ainsi qu'un gène de sélection pour la plante.

Je ne suis pas au courant de ces choses-là! Ce qui est intéressant chez Agrobacterium, c'est justement qu'elle transfère de l'ADN naturellement. Peux-tu développer ton idée?

Cordialement,

[inviteec1705dd]

Merci quand même pour toutes vos réponses

[invite17a570c1]

Salut,
j'espère que ton exam s'est bien passé.
Je suis quand même curieuse de connaître plus de détails sur certains points que tu as mentionnés. Je me doute bien que ce n'est pas trop ton envie après le partiel, mais en fin de compte le forum sert à échanger des connaissances et s'enrichir mutuellement. Donc, pourrais-tu éclaircir certaines choses, stp?

Cordialement,

[piwi]

1) les plasmides peuvent être utilisées pour faire produire une protéine d'intérêt à une cellule "hôte"

Oui.

2) le plasmide possède systématiquement un gène de sélection (pour vérifier la présence du plasmide) ainsi qu'un gène "phénotypique" - dit gène raporteur- pour verifier la présence de la séquence d'intérêt dans le vecteur plasmidique.

Absolument pas.

3) Tous les plasmides sont d'abord multipliés dans E.coli avant d'être multiplié ailleurs (bacilles, levures, mammifères)

L'amplification est meilleur dans les coli c'est certain mais si le coeur vous dit de travailler uniquement dans une levure rien ne vous en empêche du moment que votre plasmide possède une origine de réplication eucaryote.

4) Tous les plasmides possèdent donc un promoteur, une séquence de terminaison ainsi q'une séquence de liaison au ribosomes, un codon START et STOP pour chaque gène (même pour les gènes de résistance)

Oui pour les gènes qui s'expriment. Il existe des vecteurs navettes qui n'expriment pas ce qu'on insert à l'interieur. Pour ce gène là, point de tout cela.

5) Pour les bactéries, on peut ajouter une séquence "Flag" ou etiquette dans le plasmide afin de permettre une extraction plus facile de la protéine, on peut également ajouter un gène (Ompa) permettant l'excrétion dans le périplasme.
Pour les levures, les protéines sont d'office excrétées dans le milieu extracellulaire (???)
Pour les cellules de mammifères, on peut également ajouter le "Flag" ainsi qu'une séquence signal d'excretion, permettant donc l'exportation de la protéine dans le milieu extracellulaire.

Pour les Flag, les Tag & Co c'est oui. On fait on peut faire ce que l'on veut.
Pour l'excretion des protéines dans la levure disons que la cellule se débarasse des protéines en trop. Cependant dire qu'elle se débarasse de tout est un peu fort.

6) On doit tenir compte de séquences introns (tel UTR5') nécessaire pour la régulation lorsqu'on produit une protéine dans une cellulemammifères. Ces séquences doivent elles aussi être prises en compte pour les levures et bactéries? Les séquence de régulation EUC seront elles donc prises en compte chez le PROCARYOTES?

Chez les eucaryotes le premier intron est souvent régulateur (de l'expression, de la stabilité du messager). Du coup on ajoute toujours un intron dans les vecteurs d'expression eucaryote.
Pour les procaryotes le problème vient surtout du fait qu'ils n'ont pas d'intron dans leur génome et ne disposent pas de la machinerie d'excision. Du coup il vaut mieux prendre en compte les introns et les éliminer.

7) Lors de l'utilisation d'agrobacterium tuméfaciens, on crée un plasmide contenant un gène de résistance pour E.Coli et pour la plante, une origine de réplication E.Coli, une origine pour Agrobacterium, et puis deux séquence "front gauche et front droit" dans lequel on retrouve le gène d'intérêt ainsi qu'un gène de sélection pour la plante.

Je ne suis pas plantologue
Donc sur celle ci, je seche.

Cordialement,
piwi

[invite17a570c1]

Chez les eucaryotes le premier intron est souvent régulateur (de l'expression, de la stabilité du messager). Du coup on ajoute toujours un intron dans les vecteurs d'expression eucaryote.
Pour les procaryotes le problème vient surtout du fait qu'ils n'ont pas d'intron dans leur génome et ne disposent pas de la machinerie d'excision. Du coup il vaut mieux prendre en compte les introns et les éliminer.

Mais, dis, Piwi, est-ce que le 5'UTR peut être considéré comme un intron?
Je crois que non...

Je ne suis pas plantologue
Donc sur celle ci, je seche.

Cordialement,
piwi

Beh en fait, j'aime bien les Plantes. Donc, je décris la manière de bosser avec Agrobacterium telle qu'elle m'a été présentée et puis on verra ce que c'est que cette histoire ci-dessus.
Donc, notre chère Agrobacterium possède ce que l'on peut appeler un mégaplasmide (taille = 200kb), appelé pTi, qui a une OR (Origine de Réplication), une région appelée Vir, une séquence appelée T-DNA, entourée de LB et RB (séquences inversées répétées, orientées dans la même direction) et une région Occ. La région Vir contient 7 opérons (virA jusqu'à virH) et est responsable du transfert du T-DNA.
Le T-DNA a une taille de 25 kb, chacune des séquences LB et RB a une taille = 25 pb. Le T-DNA contient des gènes codant pour des enzymes impliquées dans la production des phytohormones et pour des enzymes impliquées dans la synthèse d'aa modifiées, les opines. Ce qui est intéressant c'est que le T-DNA n'est pas transcrit chez Agrobacterium.
Ce qui se passe naturellement, c'est que lorsque la plante est blessée, des récepteurs particuliers chez Agrobacterium le captent et il y a donc infection, lors de laquelle le T-DNA est transféré dans la cellule végétale et il y a production d'opines et prolifération cellulaire, ce qui provoque un cancer végétal...
Ceci pour que tout le monde puisse suivre la suite (je parle des non-plantologues )

7) Lors de l'utilisation d'agrobacterium tuméfaciens, on crée un plasmide contenant un gène de résistance pour E.Coli et pour la plante, une origine de réplication E.Coli, une origine pour Agrobacterium, et puis deux séquence "front gauche et front droit" dans lequel on retrouve le gène d'intérêt ainsi qu'un gène de sélection pour la plante.

Donc, comme le T-DNA peut entrer dans une cellule végétale, ce qui est intéressant c'est qu'on peut le remplacer par un gène d'intérêt et vive la transgenèse simple
Donc, par recombinaison entre le pTi et un plasmide contenant notre gène d'intérêt, on obtient un pTi-gène d'intérêt à la place du T-DNA. En général, ce gène d'intérêt est accompagné par un gène de sélection ou rapporteur; dans certains cas, il es possible de trouver des restes du T-DNA au sein de cette construction, mais il existe aujourd'hui des techniques (complexes, comme a dit notre prof) qui permettent de n'avoir que le gène d'intérêt à la place du T-DNA. Lorsqu'on parle de gène de sélection ou rapporteur, on parle généralement dans ce cas d'un gène permettant aux cellules de survivre dans certaines conditions précises ou tout simplement un gène rapporteur pour savoir quelles cellules ont intégré le gène d'intérêt.
Enfin, pour revenir à la question initiale d'azzurela, je ne vois vraiment pas pourquoi on devrait parler d'E. coli ici... Si je peux introduire mon gène d'intérêt directement dans la plante, pourquoi passer par E. coli? Je n'ai jamais entendu parler de ça...

Bon, j'arrête pour ce soir

Cordialement,

[piwi]

Non le 5'UTR et le 3'UTR ne sont pas des introns, il ne sont excisés. Ce sont des régions non traduites appartement respectivement au premier et au dernier exon (en général).

[invite17a570c1]

Ok, c'est bien ce qu'il me semblait. C'est par rapport à un des posts ci-dessus...
Merci
Cordialement,

[invitec9f0f895]

en effet les exons ne sont pas forcément codants
ce qui ne manque pas d'emmeler tous les étudiants

Yoyo