plasmide et BAMH1

[MagicFalco]

bonjour,

voila je vloque sur une petite question concernant des annales de microbiologie donc si quelqu'un pouvait me venir en aide

je dispose d'un plasmide comportant une cassette de clonage avec les sites de restriction spécifiques à
- Bam H1
-EcOR1
- Xho1
- Hind IIII

Le gène que je souhaite intégrer au plasmide comprend
- 2 sites de coupure BamH1
- 1 site de coupure HindIII
(dans l'ordre suivant, Bamh1, HindIII, BamH1)
mais aucun site ECoRI et ni Xho1

1) Quels sont les sites devant être présents aux 2 extrémites du gène pour pouvoir réalise le clonage?

j'ai répondu que les sites de restriction devaient être soit
- EcoRI et EcoRO
- XhoI et XhoI
ou - EcoRI et XhoI

en effet , en utilisant BamH1 ou HindIII, on entrenerait une fragmentation de notre gène

2) si vous coupez votre plasmide recombinant par bamhI combien de fragments observerez vous?

je bloque sur cette question
d'apres la question, le gène a bel et bien été intégré dans le plasmide bien qu'il fut fragmenté

par conséquent les 2 sites BAMHI du gène ont été coupés et la portion entre ces sites a disparu (le site HindIII notamment)
par conséquent sur notre plasmide, il ne reste que 2 sites bamH1 provenant de la coupure du site bamH1 present au début.
donc si on coupe ces 2 sites, on obtient logiquement 2 fragments de plasmide

cependant, dans le corrigé il est indique qu'on obtient 3 fragments et je ne vois pas pourquoi

si quelqu'un voulait bien m'expliquer ou se situe mon erreur, merci
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[Ecthelion22]

Salut,
pour la question 2, j'avouerai que je n'ai pas bien compris ton raisonnement, j'en suis désolé.
Alors je vais me contenter d'expliquer la réponse mais je ne pourrais pas expliquer ton erreur.

Tu as un plasmide recombinant donc il possède le gène. Une fois qu'on l'a, on met l'enzyme Bam H I. Sur le plasmide recombinant il y a donc 3 sites de restriction Bam HI : celui du plasmide seul et les 2 du gène qui est dans le plasmide. Donc trois coupures. Il suffit maintenant de se rappeler que le plasmide est circulaire. Tu as un cercle (et pas une droite sinon ça fait 4 fragments) que tu coupes 3 fois => tu obtiens trois fragments : un issu à 100% du gène inséré et les deux autres qui contiennent un bout du plasmide et un bout du gène inséré.

Et l'intérêt est là : tu cherches parmi tes plasmides lesquels sont recombinants et lesquels ne le sont pas. Tu as ton plasmide, tu le mets avec l'enzyme et tu fais une petite électrophorèse : si tu as 1 seul gros fragment, ton plasmide était sans le gène, si tu en as 3, le plasmide contenait le gène.

J'espère que j'ai été assez clair.
Cordialement,
Ecthelion

[jmbowie]

La réponse à la question 2, je suppose, prend en compte la réponse à la première question, à savoir que tu clones pas avec BamHi mais avec , par exemple, Eco et Xho.

On a 3 sites de restrictions:

(n)-------(BamHIplasmide1)---------//---------(BamHIgène1)-------(BamHIgène2)---//----------(retour à "n")

Donc 3 fragments (ton plasmide est circulaire)

[MagicFalco]

oui très bien merci pour votre aide

[A voir en vidéo sur Futura]