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Problème lors de ligation



  1. #1
    alex080686

    Problème lors de ligation

    Bonjour,
    Voila, je rencontre un problème lors d'une manip de ligation:
    J'ai un plasmide pcDNA3 contenant un insert qui est situé entre deux sites de restrictions Xho I, je digère ce plasmide avec l'enzyme Xho I puis je fais migrer dans un gel TAE 1% avant de récupérer mon insert et mon plasmide ouvert ( grâce à un kit wizard).
    Je déphosphoryle ensuite mon vecteur afin qu'il ne puisse pas se refermer tout seul,
    Et enfin je fais une ligation en ajoutant mon insert qui lui est phosphorylé (ratios 1:0, 1:1, 1:3, 1:6)
    Je fais rentrer mon plasmide dans mes bactéries compétentes en faisant un heat chok, puis je dépose sur agar avec l'antibiotique de sélection.
    Premier souci, j'ai des colonies qui poussent dans la boite 1:0, or il me semble puisque mon vecteur n'est pas phosphorylé que celui-ci n'a pas pu se refermer et donc il ne devrait pas y avoir de colonies...
    Le deuxième vrai soucis c'est qu'après l'extraction de plasmide (après repiquage des colonies en milieu liquide) je redigère pour vérifier que tout a bien fonctionné et la j'obtiens un smir!
    Je précise que j'ai vérifié qu'il n'y avais pas de conta dans la BSA ou le tampon on l'enzyme en réalisant un digestion sur un autre vecteur ou cela fonctionne...
    Voila, si quelqu'un sait m'aider
    Merci beaucoup

    -----


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  3. #2
    Flyingbike

    Re : Problème lors de ligation

    Normalement il peut y avoir des colonies meme sans insert. Ce qui compte c'est d'en avoir beaucoup plus avec.

    C'est le cas ?

  4. #3
    alex080686

    Re : Problème lors de ligation

    Merci de ta réponse,
    J'ai aussi des colonies sur mes autres boites, quelques unes sur la 1:1 (équivalent plus ou moins à la 1:0), et en nombre vraiment plus important sur les 1:3 et 1:6...

  5. #4
    Flyingbike

    Re : Problème lors de ligation

    tu peux nous mettre une photo ?

    quelle est la taille du vecteur/ de l'insert ?

  6. #5
    alex080686

    Re : Problème lors de ligation

    11.10.11 pcdna3-m8 non dig vs dig.jpg
    Voila une photo, en haut c'est avant digestion (donc normalement mon plasmide + insert) et en bas c'est après digestion...
    Le plasmide fait 5,4 kb, et mon insert 3,3kb

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Elendilmir

    Re : Problème lors de ligation

    Bonjour

    Quelle enzyme utilises tu pour déphosphoryler? (la déphosphorylation n'est pas toujours complète et certaines enzymes peuvent abimer l'ADN)
    As tu essayé d'utiliser une autre enzyme de restriction que XhoI pour vérifier tes minipreps?
    Les colonies que tu as utilisées pour inoculer les minipreps viennent de quels ratios? 1:3 et 1:6?
    Qui s'assied au fond d'un puits pour contempler le ciel le trouvera petit.

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