Site de restriction

[invite3876f922]

Bonjour

Je vais cloner un gène dans un vecteur (pET21a et pGEX 4-T-2) et je vais ajouter des sites de restrictions dans mes primers avant de lancer la PCR. Quels procédures peut-on suivre pour faire introduire des sites de restrictions dans les séquences de nos oligonucléotides dans le but d'une expression dans Ecoli par exemple le sens de lecture du vecteur/lecture en phase , présence de ces enzymes dans polylinker, enzymes ne coupent notre gène...
J'ai une chose que je comprend pas on choisit une enzyme qui ne coupe pas notre vecteur et qui doit être présente dans le polylinker de notre vecteur
Quelqu'un peut m'expliquer ça

Merci d'avance
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[invitec9f0f895]

Ben oui faut que le site soit présent dans le polylinker mais pas dans le RESTE du plasmide. Autrement dit ca doit etre un site unique.

pour le reste tout dépend si tu clones une CDS avec son propre codon ATG ou sans. Dans le premier cas le cadre de lecture n'a pas d'importance, dans le second il faut t'assurer que ta CDS sera en phase avec le codon ATG présent dans le plasmide.

Il ne faut pas oublier d'ajouter des nucléotides supplémentaires aux extrémités des oligos si on veut etre certains que les sites soient coupés.

Yoyo

[invite3876f922]

Yoyo je suis d'accord concernant les nucléotides supplémentaires et aussi sites présents dans le polylinker mais j'arrive pas à comprendre "en phase avec le codon ATG du plasmide .
j'ai trouvé deux enzymes (BamHI et SalI) qui sont présents dans le polylinker de mes deux vecteurs d'expression et qui ne coupent pas mon gènes comment je peux introduire ces deux site dans mes amorces pourque je puisse transférer après mon gène c'est à dire BamHI position 5' ou 3' de mes amorces et comment vérifier que mes amorces sont en phase.
Je veux comprendre comment ça marche je veux des précisions ou des "règles de bases" pour réussir ça
Merci d'avance pour vos repenses

[piwi]

Ce n'est pas bien compliqué dans le principe, il s'agit simplement de designer, disons les 20 premières bases de votre séquence et de coller un site de restriction devant. Comme les enzymes de restrictions sont des endonucléases, il faudra aussi bien penser à mettre 6 bases en amont.

Pour le sens ça donnera par exemple: 5'AGTCCTBamHIxxxxxxxxxxxxxxxxx xxx3'
Pour l'anti sens il faut ecrire: 5'xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxSalIAAGG TTCC3' et prendre l'antisens de cela!!

Pour la notion de phase, c'est très important. Les pET sont des vecteurs d'expression avec un start de transcription dans le plasmide.
Par exemple: ATGxxBamHI
Si vous avez votre séquence ATG ATC ATC ATC ATC, vous allez supprimer l'ATG et faire entrer cela en Bam. Vous aurez donc dans votre vecteur: ATGxxBamHIATATATATATATA. Ce qui sera transcrit sera ATG xxG GAT CCA TCA TCA TCA TC. Ça ne codera pour la protéine que vous attendez parce que votre séquence codante n'est pas entrée en phase par rapport à l'ATG. Il aurait fallut ajouter un nucléotide après votre site de restriction!
ATGxxBamHICATATATATATATA qui sera transcrit par ATG xxG GAT TGC ATC ATC ATC ATC

A bien réfléchir avant de se lancer.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite3876f922]

Merci piwi pou votre repense mais je pense que l'ajout de nucléotide G à cette position va modifier le site de reconnaissance de l'enzyme BamHI de GGA TCC au GGA TTG .
Je vais appliquer ce principe à cette séquence et si j'ai bien compris "je l'espère " ça sera comme suit :
Le polylinker de mon vecteur en particulier la séquence (en phase) qui va être cliver pour introduire mon insert est

CGC GGA TCC GAA TTC GAG CTC CGT CGA CAA

elle contient les deux sites de BamHI (GGA TCC) et SalI (GTCGAC), après clivage le vecteur sera donc

CGC G--------------------------------T CGA CAA

Pour introduire des amorces avec des sites de restriction en phase il faut rajouter deux nucléotides avant le site BamHI et deux nucléotides après le site de SalI ça sera comme suit

CGC GCG site bamHI----------SalI ATT CGA CAA

j'espère que j'ai bien compris
Concernant l'ajout de nucléotides je pense qu'il y a des nucléotides spécifiques pour tel enzyme ceci est en relation avec le pourcentage de clivage comment peut on les reconnaitre ??
Merciiiiiiiiiiii

[piwi]

Oui je me suis trompé en ajoutant le nucléotide dans la séquence. On voit d'ailleurs que j'ai écris qu'il fallait l'ajouter après BamHI et que je l'ai ajouté après BamHI dans la séquence. Il fallait donc lire le transcrit suivant: ATG xxG GAT TCG ATC ATC ATC ATC.

Sinon, pour la raisonnement sur la phase, je pense que vous passez encore à coté. La phase c'est simplement que le premier nucléotide de votre séquence d'intérêt doit tomber au début d'un codon si l'on prend pour départ un ATG.

ATG GGA TCC: Vous avez juste à insérer votre séquence.
ATG NGG ATC C: Il faut ajouter deux nucléotides à votre séquence.
ATG NNG GAT CC: Il faut ajouter un nucléotide à votre séquence.

La partie 3' n'est en phase de rien du tout, vous n'avez rien à ajouter (sauf si vous avez quelque chose derrière que vous souhaitez transcrire dans la foulée, ça ne semble pas être votre cas).

piwi

[invite3876f922]

Merci piwi pour votre explication très claire j'avais un doute au début mais c'est bon maintenant je vois les choses plus claires.
j'ai repris ton premier exemple et c'est bon enfin
Un grand merci