ADN de séquence inconnue, choix des enzymes de restriction.

[Getsuga_Tensho]

Bonsoir,

Voici une question qui risque fort de tomber durant l'épreuve de biologie moléculaire qui auras lieux demain, et à la quelle je suis cordialement invité (blague appart ) bref

Supposons que l'on veuille insérer un brin d'ADN de séquence inconnue dans un vecteur, comment fait-on pour choisir les enzymes de restriction idoines pour couper ce brin d'ADN au bon endroit ? (c'est à dire à ces deux extrémités, pour pouvoir cloner le brin d'ADN dans son intégralité)

J'ai eu beau retourner le problème dans tout les sens, je ne trouve pas de solution (j'ai bien deux ou trois petites idées derrière la tête mais rien de fiable à 100%)

Merci
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[Getsuga_Tensho]

Bonjour,

La question n'est finalement pas tombé à l'examen *ouf* lol

Je pense à des procédés comme la I-PCR, ou à l'utilisation de marqueurs radioactifs pour détecter l'emplacement des fameux sites de restriction mais tout cela reste assez vague :s

[Flyingbike]

je n'ai pas de réponse précise, mais j'imagine que ça dépend fortement de ce qu'on sait : est- ce un gène codant une protéine connue, un gène analogue a un autre, dans une autre espèce, ...

[piwi]

Si j'ai un fragment inconnu j'aurais tendance à ne pas essayer de couper mais à utiliser la Klenow ou la TNK4 pour rendre les extrémités du fragment franches. Du coup, j'ouvre le vecteur avec une enzyme de restriction qui génère des extrémités franches, et dont le site de restriction se trouve dans la cassette de clonage, et je ligue.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[Getsuga_Tensho]

Merci pour vos réponses

En effet j'ai oublié de le préciser, d'après mon enseignant, il s'agit la d'un produit issue d'une migration électrophortique d'origine inconnue (la belle affaire). Il a illustré sa question par l'exemple d'un chercheur ayant découvert un nouveau gène (produit d'une électrophorèse) à nombre x paires de bases, de plus il à exclu d’emblée la présence de quelconque correspondance dans les bases de données génomiques (encore mieux)

Pouvez vous m'expliquer ce qu'est la Klenow et la TNK4 ? qu'entendez vous par "rendre les extrémités du fragment franches" ?

Merci

[piwi]

La klenow est un fragment de l'ADN Pol I et pour l'autre je pense que je me suis trompé dans l'acronyme. J'ai la flemme de chercher le bon, je voulais parler de la DNA polymérase du bactériophage T4.

Grosso modo, vous avez un fragment d'ADN que vous souhaitez faire rentrer dans un plasmide. Vous ne savez pas comment il a été obtenu, vous ne connaissez pas son état. Pour le faire entrer dans un plasmide, il va vous falloir ouvrir le plasmide en utilisant une enzyme de restriction dont il existe deux types:
celles qui génèrent des extrémités cohésives 5' ou 3' sortantes. Ca donnera quelque chose du type:
ATG
TACGTA
Celles qui génèrent des extrémités franches. Ca donne quelque chose type:
ATT
TAA
L'intérêt des extrémités franches, c'est que vous pouvez les liguer entre elles sans souci.

Comme vous n'avez aucune idée de la carte de restriction de votre fragment, il est déconseillé de digérer par une enzyme, vous risquez de le casser. En revanche, vous pourrez toujours l'insérer dans un plasmide ouvert avec une enzyme générant une extrémité franche, sous réserve qu'il ait lui même les extrémités franche. Or vous ne savez rien de cela.
Donc, la méthode est faire agir des enzymes qui comblent les trous si il y en a.
Par exemple, si vous avez:
CTG
GACGTC

vous aurez à la fin:
CTGCAG
CAGGTC

Et là vous êtes certain de pouvoir liguer avec le plasmide.

Cordialement,
piwi