Comment orienter un fragment d'adn dans un vecteur

[invite27c4ff3b]

Bonjour,

Imaginons que l'on amplifie un fragment d'adn génomique avec des primers savamment choisi encadrant un gène sans ses séquences régulatrices.

On veut introduire ce fragment dans un vecteur contenant lui un promoteur, mais pour cela il faut le mettre dans le bon sens pour que l'ORF soit dans le bon sens par rapport au promoteur.

Donc pour cela je suppose qu'on peut utiliser des primers avec une partie 5' non complémentaire qui permet de générer un site de restriction différent selon le côté du fragment ce qui permet d'introduire le fragment dans le bon sens en utilisant les 2 sites différents.

Mais j'ai entendu parlé d'un système avec la phosphatase alcaline qui permet dephosophoryler les 5'P ce qui empêche l'adn ligase d'agir. Le problème c'est que c'est pareil des deux côté donc je vois pas comment ca permet d'orienter le fragment...

Merci d'avance
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[invitec9f0f895]

Salut

La phosphatase ne permettra pas d'orienter le fragment.
L'utilisation de sites de restriction est le seul moyen pour faire cela. Une autre solution est de ne pas orienter le fragment, et une fois le clonage fait tester les plasmides pour trouver ceux qui auront un insert dans le bon sens. Apres tout tu as 50% de chance que ton insert soit dans la bonne orientation.

Yoyo

[inviteac3582e5]

Salut,

A la base, tu as théoriquement préparé l'ADN à insérer de telle façon qu'il soit justement capable de s'insérer donc ses extrémités doivent être complémentaires avec celles du vecteur.

Au pire, tu peux rajouter une queue poly G sur ton fragment et une queue poly C sur le vecteur pour assurer la liaison.

[invite27c4ff3b]

ah oui la phosphatase alcaline sert juste à ce que le vecteur se recircularise pas tout seul sans le fragment

ok merci pour vos réponses

et pour la pcr avec des primers à demi complémentaires, c'est bien la partie 5' qui a le droit de ne pas être complémentaire c'est ca ? je sais jamais si c'est la partie 5' ou 3'

[A voir en vidéo sur Futura]