clonage petit fragment d'ADN

[invite9b9d2d06]

Bonjour,
j'ai un soucis de clonage d'un fragment PCR d'environ 80pb.
le plasmide dans lequel je souhaite l'insérer et ce fragment sont digérés avec XhoI 2h à 37°C.
l'enzyme est ensuite désactivée par passage à 80°C durant 20mn (comme préconisé sur la notice).
Le plasmide est déphosphorylé à l'aide d'une thermosensitive phosphatase alkalyne qui est elle-même désactivée à la chaleur.
voici les ratios insert/vecteur que j'ai testé :
insert/vecteur : 3/1 (200ng / 3.6ng) car taille vecteur 8310pb et taille insert env 50pb
ensuite je transforme dans des bactéries chimiocompétentes (50µl de bactéries + 5µl de produit de ligation soit env 41ng d'ADN)
après criblage j'obtiens des clones mais une PCR à l'aide d'amorces spécifiques de mon fragment montre qu'il n'y a pas d'insert dans le plasmide.
savez-vous d'où peut venir le pb?
merci d'avance pour vos réponses
-----

[Flyingbike]

Avez vous essayé d'augmenter le rapport insertlasmide ?

L'insert est-il bien digéré ? la digestion peut en effet mal se faire si les sites XhoI sont trop près du bord.

[invite9b9d2d06]

j'ai essayé un ratio insert/vecteur de 4/1 qui n'a rien donné non plus, je comptais effectuer un ratio 10/1...
le site de restriction XhoI se trouve à 3 pb du bord

[invite02cefc91]

As tu des nucléotides "libres" de chaque côté de ton site de restriction ? Ou as tu dessiné ton amorce en rajoutant le site de restriction ?

Moi je rajoute avant le site des nucléotides, car certaines enzymes de restriction ont besoin d'un "environnement nucléotidique" pour fonctionner !

Purifies tu ton produit pcr sur gel ? cela joue aussi !

Au lieu de faire une longue digestion, je te conseille de la faire en deux étapes d'une heure avec deux fois moins d'enzyme, tu rajoutes l'autre moitié après la 1ere heure .. Les enzymes s'épuisent avec le temps ...


Ta ligase est préconisée pour quelle température ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitef5962f47]

A la fin du catalogue NEB ou sur leur site, il donne le nombre de nucléotides qu'il faut avoir entre le bord et le site de restriction pour que la digestion se fasse de manière correcte.

Sinon une purification sur gel après la digestion peut permettre de savoir si la digestion a bien eu lieue (mettre le produit non digéré et digéré sur un grand gel d'agarose 2% que tu fait migrer sur la nuit a ~ 60 V ça permet d'avoir une assez bonne résolution pour les fragments de cette taille).

[Flyingbike]

As tu des nucléotides "libres" de chaque côté de ton site de restriction ? Ou as tu dessiné ton amorce en rajoutant le site de restriction ?

Moi je rajoute avant le site des nucléotides, car certaines enzymes de restriction ont besoin d'un "environnement nucléotidique" pour fonctionner !

Purifies tu ton produit pcr sur gel ? cela joue aussi !

Au lieu de faire une longue digestion, je te conseille de la faire en deux étapes d'une heure avec deux fois moins d'enzyme, tu rajoutes l'autre moitié après la 1ere heure .. Les enzymes s'épuisent avec le temps ...


Ta ligase est préconisée pour quelle température ?

C'est exactement ce que je disais. Visiblement XhoI n'est pas trop concernée : http://www.neb.com/nebecomm/tech_ref...ucleotides.asp

Es tu sur de ta PCR ? Pourquoi ne pas d'abord vérifier la présence de l'insert par redigestion par XhoI ?

Fais tu une transformation contrôle avec l'insert seul déphosphoré + ligase ? Y a-t-il autant de colonies que dans plasmide + insert ?

[invite9b9d2d06]

Merci à tous pour vos réponses.
Pour en dire plus à tout le monde.
Le produit PCR est effectué à l'aide d'amorces dont le site de restriction a été rajouté avec 3 nucléotides en amont. Celui-ci a été purifié à l'aide d'un kit de purification de produit PCR sans passer par une extraction sur gel car j'ai un produit bien spécifique.
La digestion avec XhoI a été réalisée en 2 étapes : 1h à 37°C avec la première moitié d'enzyme et 1h à 37°C avec la 2ème moitié.
La ligation est effectuée à 4°C sur la nuit car les bouts générés après digestion sont cohésifs
J'ai déjà essayer de vérifier la présence de l'insert par redigestion du plasmide+insert avec XhoI et vérification sur gel à 3% d'agarose. cependant je ne voyais pas l'insert. Je me disais que celui-ci était peut-être en trop faible quantité pour le voir d'où ma démarche de passer par une PCR avec des amorces spécifiques de mon insert pour le visualiser ou non.
Je n'ai pas fait de transformation contrôle avec l'insert seul déphosphorylé+ligase. Flyingbike peux-tu me dire l'utilité de ce contrôle car si je transforme mes bactéries avec ce contrôle, je n'aurai aucun transformant...
merci pour vos commentaires ou idées de génie !!!

[Flyingbike]

Je n'ai pas fait de transformation contrôle avec l'insert seul déphosphorylé+ligase. Flyingbike peux-tu me dire l'utilité de ce contrôle car si je transforme mes bactéries avec ce contrôle, je n'aurai aucun transformant...
merci pour vos commentaires ou idées de génie !!!

Re,
En fait ce contrôle permet de vérifier entre autres que l'insert est bien déphosphorylé et donc a peu de chances de se recirculariser sans l'insert. C'est un contrôle négatif tout a fait classique de ce genre de manip.

Le nombre de colonies ainsi obtenu te donne une sorte de "bruit de fond".

[Flyingbike]

Je complète :
il faut saisir que la probabilité de ligation intramoléculaire (par exemple les deux extrémités d'un vecteur) est énormément supérieure a une ligation intermoléculaire (exemple insert dans un vecteur). Donc si ton insert n'est pas totalement déphosphorylé, il a très peu de chance de se refermer avec un insert dedans. D'ou l'utilité du contrôle vecteur seul.

[Flyingbike]

J'ai déjà essayer de vérifier la présence de l'insert par redigestion du plasmide+insert avec XhoI et vérification sur gel à 3% d'agarose. cependant je ne voyais pas l'insert. Je me disais que celui-ci était peut-être en trop faible quantité pour le voir d'où ma démarche de passer par une PCR avec des amorces spécifiques de mon insert pour le visualiser ou non.

Dernier message : normalement si tu prends tes colonies et que tu les miniprep, sans PCR tu devrais voir l'insert. Tu es sur de ne pas l'avoir laissé sortir du gel ? 80 c'est assez petit, si tu as de l'agarose low melting tu peux passer a 4% pour le voir.

[invite9b9d2d06]

oui, c'est donc le vecteur seul déphosphorylé qui sert de contrôle de transformation et non l'insert seul déphosphorylé comme tu le disais !!!
je comprends beaucoup mieux comme ça !!

[Flyingbike]

oui, c'est donc le vecteur seul déphosphorylé qui sert de contrôle de transformation et non l'insert seul déphosphorylé comme tu le disais !!!
je comprends beaucoup mieux comme ça !!

ah oui effectivement. Désolé pour la confusion !