Sélection ARNm spécifique puis RT-PCR

[invite4d388bc4]

Bonsoir,
Je dois réaliser un protocole et le but final est de produire un plasmide recombinant.
Je dispose au départ des ARN totaux extraits de cellules exprimant la protéine étudiée.
Je sais le cheminement de mon protocole, mais j'ai un soucis à un moment.
Je vais purifier mes ARNm à partir des ARN totaux grâce à une colonne oligo dT cellulose.
Mais j'obtiens l'ensemble des ARNm, comment définir l'ARNm d'intérêt sachant qu'une fois que je l'aurais déterminer je dois réaliser une RT-PCR ?
Est-ce que je dois d'abord synthétiser le 1er brin d'ADNc puis jouer après sur les amorces ?
Je suis un peu bloquée et j'ai du mal à trouver des infos, même sur les protocoles de promega.
Est-ce que quelqu'un a une idée ?
Merci
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[invite826a1898]

oui c'est exactement ça !!! D'abord la RT qui transforme TOUT tes ARN en ADNc. Puis une PCR (ou qPCR) avec les amorces spécifique à ton gène d'interet....Faut juste être sûr de ces amorces, et pour ça faut séquencer puis blaster....le mieux est de le faire sur ADNg et ADNc (et tu compares...). Seulement ensuite tu pourras lancer le clonage...

[invite4d388bc4]

Merci beaucoup pour cette réponse, ça confirme ce que je voulais faire !