PCR positive puis négative

[invite61d76751]

Bonjour,

Tout est dans le titre, je travaille sur l'identification de gènes plasmidiques impliqués dans les résistances bactériennes, les gènes QNR chez les entérobactéries.
Si avec les gènes Qnr A et S, je n'ai aucun problèmes, les PCR destinés à mettre ne évidence QnrB me donne des résultats assez déroutants. Lors de ma première série de PCR, j'ai pu identifier un quarantaine de souches positives après dépôts sur agarose. Les produits d'amplification positif sont ensuite purifiés par exo-sap pour un séquençage du gène, avec les même amorces que celles utilisé pour la première PCR. Seulement sur les 40 souches testé 20 sont sortis négatives du séquençage, pensant avoir fauté quelque part j'ai retesté une réaction de séquençage sur ses souches sans conviction, j'avais séquencé d'autres gènes en mêmes temps, et bien sûr le séquençage fut négatif.
J'ai donc voulu retester en double cette fois la PDR d'uidentification, pour être sûr d'éliminer les ennuis techniques et cette fois toutes mes souches, sortis QnrB positives la première fois, ont toutes montré un profil négatif, à l 'exception de deux que j'ai pu séquencer en doublant la quantité d'ADN.
Je pensais qu'il pouvait s'agir d'un problème du aux congélation décongélation ou à l'âge des échantillons mais ikls ont tous des âges différents et des cycles congélation-décongélation différents.

D'où peut provenir le problème ?
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[jmbowie]

Bonjour,

Tout est dans le titre, je travaille sur l'identification de gènes plasmidiques impliqués dans les résistances bactériennes, les gènes QNR chez les entérobactéries.
Si avec les gènes Qnr A et S, je n'ai aucun problèmes, les PCR destinés à mettre ne évidence QnrB me donne des résultats assez déroutants. Lors de ma première série de PCR, j'ai pu identifier un quarantaine de souches positives après dépôts sur agarose. Les produits d'amplification positif sont ensuite purifiés par exo-sap pour un séquençage du gène, avec les même amorces que celles utilisé pour la première PCR. Seulement sur les 40 souches testé 20 sont sortis négatives du séquençage, pensant avoir fauté quelque part j'ai retesté une réaction de séquençage sur ses souches sans conviction, j'avais séquencé d'autres gènes en mêmes temps, et bien sûr le séquençage fut négatif.
J'ai donc voulu retester en double cette fois la PDR d'uidentification, pour être sûr d'éliminer les ennuis techniques et cette fois toutes mes souches, sortis QnrB positives la première fois, ont toutes montré un profil négatif, à l 'exception de deux que j'ai pu séquencer en doublant la quantité d'ADN.
Je pensais qu'il pouvait s'agir d'un problème du aux congélation décongélation ou à l'âge des échantillons mais ikls ont tous des âges différents et des cycles congélation-décongélation différents.

D'où peut provenir le problème ?

On peut imaginer beaucoup de choses: mauvaise qualité de l'extraction, présence d'inhibiteurs (tu fais tes PCR sur ADN ou sur colonies?), ou de la présence de contaminations la première fois!
Essaie de travailler par moins d'échantillons, et sans faire de témoins positif si tu es sûr que ta PCR fonctionne et que tu manips consciencieusement, de façon à minimiser le risque de conta.


PS: le bonjour à Patrice N. !

[invite61d76751]

Je fais mes PCR sur des extraits de colonies lysées mais je ne pense pas à la présence de contaminants ou d'inhibiteur car je travaillais sur des souches qui provenait d'établissement différent et les profils était les mêmes pour tous, d'autre part ces problèmes ne sont apparus que pour un seul gène.
Il est vrai que j'ai eu des faux positifs avec une bande qui apparait 100pb plus bas mais même en sa présence j'ai pu séquencer mon ADN et lorsque je 'ai refait cette manip en double, ma collègue et moi avanons eu tous les deux ce faux positif, ce qui me semble invalide l'hypothèse d'un contaminant.

[jmbowie]

Je fais mes PCR sur des extraits de colonies lysées mais je ne pense pas à la présence de contaminants ou d'inhibiteur car je travaillais sur des souches qui provenait d'établissement différent et les profils était les mêmes pour tous, d'autre part ces problèmes ne sont apparus que pour un seul gène.
Il est vrai que j'ai eu des faux positifs avec une bande qui apparait 100pb plus bas mais même en sa présence j'ai pu séquencer mon ADN et lorsque je 'ai refait cette manip en double, ma collègue et moi avanons eu tous les deux ce faux positif, ce qui me semble invalide l'hypothèse d'un contaminant.

Essaie peut-être de baisser un peu la température d'annealing, et compare aussi avec des ADN plasmidiques extraits. C'est du boiling que tu fais non?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite61d76751]

Oui c'est du boiling que je fais, je vais essayer de changer les températures d'annealing mais il est curieux de voir cohabtiter deux tyes de résultats sur une même plaque de PCR.