SYBR green et BET (ou la non compréhension de la PCR en temps réel)

[invite6d0c1baa]

Bonjour !

Je suis en train de réviser ma biomol et j'ai du mal à voir la différence entre la PCR "classique" et la PCR en temps réel.

La différence entre les deux serait l'utilisation de molécules différentes : le SYBR green et le BET, qui tout deux s'intercalent entre les bases ( d'après ce que j'ai compris) et pourtant le premier sert dans une méthode quantitative et le second ne permet que de faire une PCR semi quantitative.

Pourriez vous m'aider à comprendre les différences entre ces deux méthodes ?

Je vous remercie !
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[invite826a1898]

Dans la PCR classique, le BET n'est ajouté que lors du gel (directement dans le gel ou via un bain contenant du BET), il s'intercale dans les molecules d'ADN et fluoresce sous UV. Il permet une semi quantification car en général on revele en fin de reaction donc il s'agit d'une quantité finale. Mais peut être biaisé puisque la quantité finale dans ce cas n'est pas toujours relative a la quantité initialement présente. En effet après un grand nombre de cycle la Taq s'épuise, il y a moins de dNTP, plus d'inhibiteurs etc....
Dans la qPCR, le sybrgreen (ou autre molecules fluorescente selon la méthode) est ajouté directement dans le milieu. dans le cas du Sybrgreen il ne fluoresce que dans l'ADN double brin. Le thermocycleur va donc prendre une mesure de cette fluorescence à la fin de chaque cycle, grace a une courbe d'étaloonage on pourra quantifier la quantité d4ADN initialement présente.

c'est un peu rapide et un peu simplifié mais en gros c'est ça !!!

[invite853321bf]

Dans la qPCR,

la qPCR n'est qu'une application particulière de la PCR Temps-Réel, merci de ne plus colporter ce vilain raccourci
Dans le cas de la PCR Temps Réel, le suivi de la fluorescence permet de voir en temps réel l'augmentation de la fluorescence. Elle permet même sans quantifier, de mieux différencier les positifs des négatifs.
La différence est que la PCR en soi n'est qu'une technique amplifiant une section d'ADN, il faut ensuite pouvoir l'identifier le plus souvent en faisant une migration sur gel d'agarose coloré au BET (et encore, on peut très bien se servir du Sybr Green). A la fin de la PCR Temps Réel, on a les courbes d'amplification et de fusion Melt Curve, qui permet de vérifier que l'amplification est bien du bon fragment, donc on gagne du temps et du matériel.

L'usage du BET pour l'un ou l'autre est plus arbitraire qu'autre chose. Le Sybr Green émettant moins de fluorescence que le BET, on préfère garder le BET pour le gel d'agarose étant donné que parfois... ben c'est un peu dur à voir . L'utilisation du Sybr est prévilégiée pour sa toxicité moins importante que le BET, c'est tout Rien n'empêche d'utiliser l'un ou l'autre pour les deux usages.

[invite826a1898]

euh...je crois que j'ai répondu qu'a la moitié de la question posé en fait...quand on ne lit pas bien l'ennoncé on ne peut pas répondre clairement et me suis juste arreté a la difference entre l'utilisation du BET et du SYBR
mea très très culpa

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite6d0c1baa]

Merci beaucoup pour vos réponses, tout est clair dans mon esprit maintenant !