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Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot



  1. #1
    noirdez

    Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

    Bonjour à tous,

    Je travaille sur un facteur de transcription (Nrf2). En l'identifiant par western blot, on constate qu'il migre à une hauteur de +/- 100kDa, alors que son poids moléculaire est de 66 kDa. Cela a été déjà démontré dans plusieurs papiers, donc jusqu'ici pas de soucis. Dans la littérature, on trouve que les nombreux résidus acides (dont la sérine), pourraient etre responsables de cette migration aberrante dans un gel SDS-page. Cependant, je n'arrive pas à trouver plus d'info sur le "Pourquoi" de cette migration aberrante ...
    Pourriez-vous m'aider ?

    Un tout grand merci,

    Eva

    -----


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  3. #2
    chamouulox

    Re : Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

    Je ne connais pas le facteur en question, mais possiblement l'état de glycosylation peut jouer? Si toutes les sérines sont outrancièrement glycosylées...
    Une dimérisation du facteur impliquant les sérine? (20kDa de différence avec les 120kDa attendus, why not)
    La liaison covalente d'un groupement un peu funky au niveau d'une des sérines?

    Cham,

  4. #3
    noirdez

    Re : Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

    A priori mon facteur de transcription n'est pas glycosylé ... Par de dimérisation non plus... Et a priori pas de groupement funky non plus Mais merci pour ton imagination

    Mon promoteur avait l'air de dire que c'était simplement ces aa acides qui pouvaient être responsables de cette drôle de migration. Mais le bougre est parti en vacance et ma défense de mémoire est ce vendredi

    Merci d'avance

  5. #4
    Droopx

    Re : Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

    Bonjour,

    Les premières idées qui me viennent en te lisant peuvent peut-être répondre à ta question.

    - As-tu bien dénaturé ta protéine? bouilli et utilisation de Beta mercapto (ou autre) en suffisance? Car pour moi ta protéine a peut-être gardé une partie de sa structure 3D, ce qui l'empêche de passer les mailles formés par ton gel et donc de migré. Ceci pourrait en faite le bloqué avant la taille attendu. ( Si comme lors d'une partie de mon mémoire, je devais garder ma protéine dans sa conformation 3D, alors c'est fort probable qu'elle soit bloqué par les mailles comme j'ai eue le cas. Ou alors elle sont associé avec une autre protéine ou acide aminé comme tu le penses)
    - As-tu utilisé assez de SDS afin de charger négativement toute ta protéine?
    - Es ce que ton smart ladder ou ton témoin de taille et tes échantillons ont le front de migration parallèle (je sais pas comment expliqué, j'ai dû mal...)?
    - Si tous les WB sont pareils avez-vous essayé en réaliser une migration plus long en diminuant le voltage?

    Voilà ce qui me vient, maintenant, ce n'est que des voies potentielles à explorer.
    J'espère que d'autre personne auront d'autre idée, ou les mêmes que les miennes !!!

    Courage pour ta défense,
    Cordialement,

    Droopx

  6. #5
    noirdez

    Re : Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

    Salut Droopx,

    Merci pour tes idées.
    Cette observation en western blot s'est faite à plusieurs reprises, que ça soit dans mon travail (pour des migrations à plus haut ou plus bas voltage), ou dans d'autres papiers. Je doute que ça soit un question de problème de migration, de dénaturation, ou encore SDS et de charge négative.
    J'ai vraiment l'impression, via les différents papiers sur Nrf2 ou sur d'autres protéines, que la raison de cette migration aberrante est la forte proportion d'acides aminés acides dans la séquence. Mais je ne comprends pas pourquoi ces aa acides engendreraient une migration plus lente...
    Je continue à chercher sur PubMed etc. Si je trouve une explication logique, je reviens vers vous

    Belle journée,
    Eva

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Flyingbike

    Re : Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

    quel est le pHi de ta protéine ?

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  10. #7
    noirdez

    Re : Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

    C'est sans doute une très bête question, mais où trouve-t-on cette information ?
    Ma protéine est le facteur de transcription "nuclear factor erythroid 2-related factor 2 isoform 2" ou Nrf2, famille des protéines CNC.

  11. #8
    Flyingbike

    Re : Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

    je trouve un pI de 4,82

    elle a l'air en effet un peu particulière. mais si je suis pas totalement idiot, dans le pire des cas elle devrait migrer plus rapidement qu'une protéine avec un pI plus élevé, non ?

  12. #9
    noirdez

    Re : Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

    Oui, avec un pI < pH, charge globale négative .... donc plus attirée vers la charge positive de l'électrode ... bizarre !

  13. #10
    noirdez

    Re : Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

    Mais en même temps, le SDS est là pour que toutes les protéines aient la même charge ... le pI ne rentrerait donc pas en jeu !

  14. #11
    LXR

    Re : Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

    Si la protéine a globalement une charge négative à l'état natif, peut-être qu'il y a une répulsion partielle du SDS qui a la même charge. La dénaturation de la protéine est peut-être moins efficace de ce fait ou sa charge est moins négative qu'une protéine qui réagit bien avec le SDS. C'est très spéculatif.
    Never give up.

  15. #12
    noirdez

    Re : Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

    Oui, cette idée corrèle avec une info disant que le SDS se lie mal aux résidus acides ! Ce qui engendrerait une dénaturation moins efficace.
    Spéculatif, mais c'est une hypothèse qui se laisse écouter

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  17. #13
    Droopx

    Re : Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

    Re,

    Je t'avoue, j'ai beau cherché une petite raison plausible au problème. Tu parles de nombre important de Serine dans ta séquence protéique, es ce si important que ca? es ce qu'elles sont placé à des endroits spécifique genre chainette je veux dire?

    Je pensais toujours à la taille de la molécule mais comme tu dis qu'elle est totalement dénaturé et comme tu le souligne le Pi est bon et e SDS doit en effet mettre les charges toutes négatives. Je n'arrive pas expliquer et je t'avoue que je n'arrive plus à travailler au boulot à cause de ton problème .

    Est-il possible que la conformation même de l'a a serine joue un role au niveau volume qu'il prends mais en même temps si une sérine arriverait à faire 100 KDa, on n'aurait beaucoup de problème dans les western blot.

    La sérine aurait une possibilité d'intéragir au niveau structurel avec un autre aa de ta séquence malgrè la présence de dénaturant? Même si au moment de l'injecté elle est dénaturé, le fait que le tampon de migration dilue le composée dénaturant et imaginant que ta protéine a une vitesse de reconformation 3D rapide, alors il est possible que ...

    Je crois que je me prends trop la tête et je commence à réinventer les intéractions chimique.

    Si tu trouve pas avant ta défense, peux tu demander après ta défense à ton prof le pourquoi et nous l'écrire?

    Désolé,
    Bonne journée et bonne lecture

    Si tu trouve la réponse, fais le moi savoir au plus vite.

  18. #14
    noirdez

    Re : Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

    Rebonjour,

    En N-term il y a une région riche en glutamate et aspartate.
    Comment savoir si la prot a une vitesse de reconformation 3D rapide ?

    Mon promoteur est actuellement en vacances, mais dès son retour (et dès le mien, donc fin juillet :s), je lui demanderai !
    Belle journée,

    Eva

  19. #15
    LXR

    Re : Protéine avec bcp de résidus acides migre de façon aberrante en western blot

    Citation Envoyé par Droopx Voir le message
    Re,

    Je t'avoue, j'ai beau cherché une petite raison plausible au problème. Tu parles de nombre important de Serine dans ta séquence protéique, es ce si important que ca? es ce qu'elles sont placé à des endroits spécifique genre chainette je veux dire?

    Je pensais toujours à la taille de la molécule mais comme tu dis qu'elle est totalement dénaturé et comme tu le souligne le Pi est bon et e SDS doit en effet mettre les charges toutes négatives. Je n'arrive pas expliquer et je t'avoue que je n'arrive plus à travailler au boulot à cause de ton problème .

    Est-il possible que la conformation même de l'a a serine joue un role au niveau volume qu'il prends mais en même temps si une sérine arriverait à faire 100 KDa, on n'aurait beaucoup de problème dans les western blot.

    La sérine aurait une possibilité d'intéragir au niveau structurel avec un autre aa de ta séquence malgrè la présence de dénaturant? Même si au moment de l'injecté elle est dénaturé, le fait que le tampon de migration dilue le composée dénaturant et imaginant que ta protéine a une vitesse de reconformation 3D rapide, alors il est possible que ...

    Je crois que je me prends trop la tête et je commence à réinventer les intéractions chimique.

    Si tu trouve pas avant ta défense, peux tu demander après ta défense à ton prof le pourquoi et nous l'écrire?

    Désolé,
    Bonne journée et bonne lecture

    Si tu trouve la réponse, fais le moi savoir au plus vite.
    Il serait bon pour toi de revoir tes cours de biochimie. Où as-tu vu qu'une sérine pouvait adopter une conformation particulière? Dans une protéine, une séquence peut adopter une conformation mais pas un acide aminé seul. D'autre part, seule la phosphorylation de la sérine pourrait diminuer la migration de la protéine car un groupement phosphate est encombrant. Mais pas causer une telle différence de migration. Je ne comprends pas vraiment ta focalisation sur les sérines.

    Il ne devrait pas y avoir de renaturation de la protéine durant la migration puisque normalement noirdez a coulé des gels contenant du SDS pour migrer en condition dénaturante, et le tampon de migration contient une quantité élevée de SDS. La seule renaturation qui peut avoir lieu est, a priori, durant le transfert car on dissocie le SDS de la protéine. Donc la renaturation spontanée est probablement pas en cause dans le problème rencontré.
    Never give up.

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