Interprétation courbe qPCR

[invite526c0af3]

Bonjour à tous !

Après plusieurs recherches infructueuses, je me décide à poser directement la question qui me taraude :

J'effectue des qPCR sur des matrices intestinales, j'utilise 2 amorçes universelles pour bactérie (16S), ma gamme a un MT compris entre 84 et 85.5, avec une efficacité comprise entre 90 et 110%.
Mon problème vient de la courbe des MT de mes échantillons, elle ne devrait comporter qu'un seul pic vers 85, or un deuxième pic apparait vers 87...
Je cherche l'origine de ce 2ème pic...

Pour chaque échantillon, j'ai 2 répétitions biologiques et je travaille avec des triplicats techniques, qui me donnent tous 2 pics, sachant que sur 6 matrices différentes, 2 fonctionnent correctement (cad 1 pic).

Quequ'un aurai-il une idée ?

Cordialement, Voragine.
(jeune étudiante en stage volontaire, et qui voudrait faire de la microbiologie son métier *o*)
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[inviteb3a6feac]

bonjour

Vous utilisez quelle chimie ? SybrGreen ou Taqman ?
En SybrGreen, vous pouvez avoir une amplification aspécifique d'un doublet dû à la technologie de PCR elle-même.

Cordialement
Nowell

[invite526c0af3]

Bonsoir !

J'utilise du Sybr green.
Admettons, mais alors pourquoi ce problème uniquement sur les échantillons de ce compartiment intestinal (et pas sur les deux autres), pourquoi ai-je eu ce problème avec les amorces bactériennes, alors que j'ai réalisé les même qPCR sur les même échantillons avec des amorces protozoaires et fongiques ?

[inviteb3a6feac]

J'ai des papiers techniques au labo sur les pourquoi du comment le SybrGreen peut faire des trucs pas cool. Le problème est que ce genre de chose est ultra aléatoire.
Je vous dirai ça demain.

nowell

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite526c0af3]

Très bien !

Merci en tout cas, c'est sympathique de votre part

[inviteb3a6feac]

En SybrGreen, vous avez la possibilité de générer des dimères d'amorces, dû à votre de design de primer qui n'est pas bon, ou alors à une concentration de primers à T0 trop élévée.
Essayez en vérifiant donc vos primers, vous verrez surement un différence.

Cordialement Nowell

[invite526c0af3]

S'il y avait un problème avec les primers, le problème se poserait sur tous les échantillons, ou du moins une majorité d'entre eux non ? Or ce n'est pourtant pas le cas...

S'il y a un problème aléatoire, il ne devrait pas se poser uniquement sur un seul segment intestinal, avec un seul genre, enfin logiquement.

[inviteb3a6feac]

Quoiqu'il en soit, votre courbe avec 2 TM proches est totalement caractéristique d'un dimère d'amorces.
Quant à savoir exactement pourquoi, je vous ai donné 2 des plus grosses pistes qui causent des dimères. Avez vous répété votre manip ? Si ce n'est pas encore le cas, il peut simplement s'agir d'un erreur de pipetage lorsque vous mettez vos amorces dans les puits.

Cordialement
Nowell

[invite526c0af3]

J'ai effectué la manip' 3 fois en tout (pour ces données là, sinon en tout et pour tout j'ai effectué 7 plaques avec des résultats propres et significatifs sur ces échantillons), dont une fois avec des échantillons anormaux et normaux, tous séparé par une colonne vide (pour éviter les contaminations) [c'était un test], j'obtiens toujours les mêmes profils.

J'ai également passé ces échantillons en PCR classique, seul le gène d'intérêt est resorti, le témoin était propre et aucune autre bande n'était visible, si dimères il y avait eu, nous aurions pu les repérer à la PCR classique non ?

Le problème avec la piste des dimères, c'est que leur formation se répète toujours au même endroit, sur le même type d'échantillon, à chaque répétition... Sur les 81 puits que je remplis par plaque, cela représente 24 puits, c'est peu, et vraiment étrange que cela ne se soit pas produit sur les autres plaques ou les autres segments intestinaux.

Peut-on envisager le fait qu'il y ait finalement 2 communautés bactériennes distinctes bien que mon amorce soit spécifique du 16S (donc universelle logiquement) ?

[invite526c0af3]

Je double poste :

Notre inquiètude la plus importante serait que ce pic soit du à une contamination, j'aimerai donc savoir, pour des amorces bactériennes, à partir de quel CT pour le témoin négatif je peux considérer qu'il y a un problème ?

Je rajoute aussi une question pour toi Nowell : Quand tu me parles de la formation de dimères, à quelle température de melt curve se voient-ils ?

Demain je lancerai une qPCR avec plusieurs témoins négatifs et primer (aliquots déjà utilisés, et aliquots neufs), pour comparer les CT obtenus, cela nous permettra d'écarter une éventuelle contamination.

[inviteb3a6feac]

Justement normalement vous avez une second pic très proche du pic d'intéret de votre courbe de melting. C'est une question de quelques degrés.
SI votre contamination est forte, vous allez avoir des CT très précoces qui sortent. Mais je ne comprends pas entièrement votre questionnement sur le témoin négatif, et décréter une baseline problématique de CT...

Nowell

[invite526c0af3]

Seulement quelques degré ? D'autres sources indiquent que les dimères apparaissent vers 72°C, ce qui est tôt, mes 2 pics sont à 85 et 86.5...

Des CT précoces ? Pouvez-vous préciser ? Leur valeur sera faible parce qu'amplifié très tôt ?

Nous utilisons une gamme pour comparer nos échantillons, si les valeurs obtenues n'entrent pas dans la gamme nous ne pouvons pas faire de comparaison... Et ces témoins négatifs à un CT de 30, sont à la limite de la gamme, puisqu'à 10^-8 le CT est de 28/30...

[inviteb3a6feac]

Bigre !
Je ne sais plus quoi penser, je m’emmêle avec toutes les infos de vos q-PCR ^^
je suis à sec d'idées !^^

[invite14397db8]

Tu veux dire que dans ton échantillon négatif, qui ne contient pas d'ADN, tu as une CT de 30?

[invite526c0af3]

Oui !

Il n'y a que de l'eau dans les témoin nég'...
Après l'enzyme Taq utilisée dans le Sybr green est issue d'une souche bactérienne, c'est peut-être pour ça qu'il y a une amplification. Je vais faire plus de biblio à ce sujet, pour savoir à partir de quelle souche l'enzyme est extraite.

J'ai relancé une plaque avec plusieurs témoins négatifs avec mes produits habituels d'un côté et des témoins nég avec des produits issus de tubes neufs de l'autre, avec un point de gamme et un échantillon, traités en triplicat avec les 2 mix.
Vers 14h nous en aurons le coeur net sur cette histoire de contamination, je pense.

Si ce n'est pas une contamination, ma question restera quand même entière sur ce problème de double pic

[invite14397db8]

En dehors de cette CT de 30, que te dit la valeur "amplification" pour cette échantillon négatif?

[invite526c0af3]

Qu'entends-tu par valeur "amplification" ?

[invite526c0af3]

Alors ma qPCR test montre que les témoins neg sortent encore avec un CT aux alentours de 30, mais mon échantillon ne se comporte pas de la même manière...
Avec les anciens produits de PCR, j'obtiens 2 pics, avec de nouveaux produits je n'en ai plus qu'un (un peu moche certes, mais un seul). Nous en concluons que la contamination devait provenir de l'eau miliQ, la piste des dimères est définitivement écartée, et je repasse tous mes échantillons avec de l'eau propre, aliquotée et congelée. Enjoy.