courbes qpcr et dilution

[invite826a1898]

Bonjour,
Nous avons effectué une gamme de dilution pour un mix d'ADNc (ayant subi une étape d'amplification) pour faire de la quantification relative. Le souci se pose pour les deux premiers points de gamme. Sachant que nous avons fait le 2eme point en diluant au 1/2 le premier point (ce sont donc les plus concentrée de la gamme).
Cette dilution est fait pour 3 génotypes différents (donc a chaque fois des échantillons de départ différents). Les 3 premeirs et les 3 deuxième points sont a des concentrations identiques.

Le HIC c'est que l'on a le même Ct a chaque fois pour les 2 premiers points et chacun des génotypes (ce n'est donc pas un problème de dilution).

Ensuite la courbe de l'échantillon plus concentrée donne un plateau plus bas et une pente plus faible.

A quoi cela est du????

merci pour votre aide
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[Flyingbike]

ça peut arriver quand un échantillon est trop concentré, essaie de tout diluer par 2 ou 3 ça devrait disparaitre.

[invite853321bf]

Bonjour,
Nous avons effectué une gamme de dilution pour un mix d'ADNc (ayant subi une étape d'amplification)

Ce ne serait pas plutôt une étape de Reverse transcription ?
Sinon, comme l'a dit Flyingbike. La PCR Temps Réel double tous les brins d'ADN qu'en théorie, tu as atteint la réalité . Là comme ça je dirais que soit tu n'as pas assez d'amorces, soit pas assez de Taq. je pencherais plutôt pour la deuxième.
La quantification (absolue ou relative) ne peut être faite que sur une plage de concentration d'ADN dans le mix, il faut avant "jouer" avec les dilutions pour se situer dans cette plage, comme pour une lecture au spectrophotomètre en vue de déterminer la concentration d'ADN