qPCR...

[invite37a064bd]

Bonjour à tous !

voilà qui résume bien...

Je fais actuellement de la RT-PCR, mais le labo ou je travaille cherche à acheter une qPCR et c'est moi qui doit déterminer nos besoins... Le problème s'est que je ne m'y connais pas trop et étant la seule à travailler au labo, il n'y a pas vraiment quelqu'un ici qui peut m'aider à décider quelle est la meilleure option.

Mon patron aimerait faire des PCR le moins cher possible et donc essayer de créer notre propre "kit" avec tout ce qui faut (c'est surtout là que pour moi ça se corse...)

Voilà mes problèmes -> questions :

1. Qu'est-ce qu'il faut vraiment dans une qPCR ? Je suis un peu perdue et je suis une habituée au kit One-step RT-PCR.
2. Est-ce compliqué de "confectionner" un probe ?
3. Combien de couleur est-ce qu'il est vraiment utile d'avoir ? (sachant qu'il y des fournisseurs qui propose de 3 à 5 couleurs...)
4. Quelles couleurs sont le plus utiles ? (parce que là entre sybr, texas, hex, tet... je sèche)
5. ... des suggestions ?

Merci d'avance grandement de vos réponses
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[invite853321bf]

Mon patron aimerait faire des PCR le moins cher possible et donc essayer de créer notre propre "kit" avec tout ce qui faut (c'est surtout là que pour moi ça se corse...)

Si tu veux dire par là les amorces et les sondes, oui on peut les faire fabriquer, et avoir une action plus spécifique par rapport à l'organisme étudié, mais que ce soit moins cher qu'un kit commercial, je suis pas sur.

Voilà mes problèmes -> questions :[LIST=1][*] Qu'est-ce qu'il faut vraiment dans une qPCR ? Je suis un peu perdue et je suis une habituée au kit One-step RT-PCR.

Il faut un thermocyleur couplé à un appareil de lecture de fluorescence (bref un thermocycleur Temps Réel), et donc dans ta plaque (ou tube selon le modèle de thermocycleur) il te faut un fluorophore, qui peut être libre comme le Sybr Green, ou lié à une sonde telles que les Taqman.

[*] Est-ce compliqué de "confectionner" un probe ?

Euh... si on parle de la conception biochimique, je suppose, vu le prix qu'on paye pour. En gros, un couple d'amorces tourne sous les 10 € les 100µM, pour une sonde Taqman c'est aux alentours des 150 €
Pour la partie création de la probe, il faut s'amuser avec la bio-info, et là ça dépend du nombre de séquences dont on dispose pour faire cette recherche ainsi qu'un peu de chances.

[*] Combien de couleur est-ce qu'il est vraiment utile d'avoir ? (sachant qu'il y des fournisseurs qui propose de 3 à 5 couleurs...)

Ça il faut que tu vois avec ton chef quels sont ces projets. Le but d'avoir plusieurs canaux est de pouvoir faire de la multiplex. Tu mets 5 sondes avec 5 fluorophores différents dessus, émettant dans des gammes du spectre différents, et hop tu peux suivre 5 amplifications en même temps (en théorie, en pratique j'ai pas encore vu de "vraies" qPCR quintuplex dans la biblio, du moins dans mes domaines, mais des PCR permettant par exemple d'identifier une bactérie parmi 5 possibilités).
Si vous ne voulez pas faire de multiplex, vous pouvez prendre un One-Channel, ciblant le Sybr Green et le FAM.
Mais bon, il est quand même bon de prévoir un peu plus "au cas où", même si bien sur le prix augmente (mais ils sont souvent assez ouverts pour faire de belles réductions sur ces petits monstres)

[*] Quelles couleurs sont le plus utiles ? (parce que là entre sybr, texas, hex, tet... je sèche)

Ben, j'ai répondu au dessus, Sybr Green en libre et FAM en liée.
Pourquoi ? Parce que. Le sybr Green reste le fluorophore ayant permis l'essor de la PCR Temps - Réel, et le FAM est dans la même gamme d'excitation que le Sybr Green, donc a été le premier fluorophore utilisé en sonde (du moins à ma connaissance).
Mais bon, il existe maintenant des fluorophores dits de seconde génération bien mieux que le Sybr Green. Je vais pas faire la liste, chaque boite a le sien. Ça reste encore peu connu car ils le proposent surtout pour des techniques telles la HRM, mais j' en utilisais en PCR Temps Réel car les résultats sont plus... jolis

[*] ... des suggestions ?

Se renseigner sur leur contrat de maintenance et la garantie, ils récupèrent une partie des réductions accordées sur le prix de vente avec ces contrats, qui sont souvent peu clairs sur les services réellement fournis. Mais bon ça marche, les gens souvent s'en fichent et se contentent d'accepter de "payer".

La métrologie peut également être importante, à savoir si vous la faites vous même, s'assurer que votre appareil peut le faire et sinon combien est facturé ce service (même si ton labo n'est pas dans un tel processus, y a de bonnes chances qu'à un moment il soit obligé)

Tu as aussi les pentes de chauffage-refroidissement qui peuvent être importantes; si mes souvenirs sont bons, on considère que 5°C / sec est une bonne pente, au dessus il y a un risque important d'"overheat" (si ta température d'étape est à 95°C par exemple, l'appareil montera en fait au dessus puis ajuster donnant un aspect sinusoidal au début des étapes si on observe l'évolution de la température. Si la température monte trop vite, l'overheat est important et l'arrivée à bonne température peut également l'être, pouvant ainsi altérer ton résultat).


Quoi d'autre ? le nombre de blocs Peltier peut également être important. En gros plus t'en as, plus la température sera uniforme. Avec un seul bloc Peltier (surtout pour une plaque 96 puits), on a des effets bords, à savoir que la température sur les bord du bloc est inférieure à celle voulu, et donc les résultats de ces puits sont peu fiables (36 puis sur 96, aïe)
Là comme ça... je vois pas trop.
Ah si tu as aussi le format des données et comment le récupérer / retraiter. je pense qu'à l'heure actuelle tous les thermocycleurs temps réel fonctionnent (ou peuvent fonctionner) avec un ordinateur couplé. C'est pratique pour retravailler ces données ou simplement créer son run, maintenant si tu n'as droit qu'à une copie du logiciel, ça voudrait dire que seul l'ordi utilisé pour la PCR permet le traitement des résultats. Ça pourrait donc être la guerre pour utiliser l'appareil mais également pour le traitement des données !!! Il est pratique d'avoir plusieurs copies du programme ou le droit de l'installer partout. Perso, le logiciel que j'avais avait cette facilité, j'avais donc même pu l'installer sur mon ordi perso pour travailler chez moi comme un bon petit thésard qui se respecte

Voilà, là comme ça je vois pas trop plus, mais je suppose que d'autres combleront les manques.
Bon courage, rédiger un cahier des charges seul est difficile, voire impossible de déterminer les besoins de tout le monde et des futurs projets.

[invite37a064bd]

Merci Kamor de ta réponse très développée !

Ça il faut que tu vois avec ton chef quels sont ces projets.

Le problème c'est que mon chef est un vétérinaire qui connait pas grand chose au labo, lui ce qu'il veut s'est des résultats fiable.

Si tu veux dire par là les amorces et les sondes, oui on peut les faire fabriquer, et avoir une action plus spécifique par rapport à l'organisme étudié, mais que ce soit moins cher qu'un kit commercial, je suis pas sur.

L'affaire, c'est que ce n'est pas que le prix mon problème... Je cherche à savoir s'il y a certain virus dans mes échantillons et il n'y a pas encore de kit pour ça ou c'est compliqué de ce faire livrer outre atlantique (au Canada) (3 virus, 2 problèmes... actuellement 1/3 solution ).

Juste une petite question : La seule différence entre une PCR "standard" et une real-time PCR au niveau des réactifs c'est les fluorophores, je me trompe ?

Merci encore.

[invite853321bf]

Bonjour,
au niveau réactif, c'est cela. Il faut une molécule qui permet le suivi en Temps Réel et ce sont les fluorophores, qui peuvent donc être libres ou fixés sur une sonde.
En fait ce que je voulais dire par "voir avec le chef", c'est savoir quel projet il compte défendre bientôt. Selon les études, une thermocycleur multiplex n'est pas obligatoire. Mais si le prix n'est pas un problème, effectivement pourquoi se prendre la tête alors

[A voir en vidéo sur Futura]