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PCR problème de poids moléculaire



  1. #1
    Eno34

    PCR problème de poids moléculaire

    Bonjour,
    Alors voilà j’ai reçu un plasmide d’un collaborateur contenant une séquence qui m’intéresse. Je dois récupérer cette séquence pour la sous-cloner dans un autre vecteur. J’ai donc designé 2 primers contenant le début ou la fin de ma séquence + un site de restriction enzymatique. Le problème est qu’après PCR j’obtiens un fragment à environ 3500pb au lieu des 2300 attendues. Après avoir essayé différentes températures d’hybridation, différentes TAQ… j’ai fini par envoyer à séquencer et pas de problème la séquence voulue est bien là… donc j’ai designé de nouveaux primers car les premiers avaient un Tm très différent, et après PCR je retombe encore sur cette bande trop haute + une bande vers 750, comme avec les précédents primers. J’ai fini par récupérer cette bande pour voir ce que ça donnait après digestion par les 2 enzymes présentes dans mes primers et je récupère encore cette bande à 3500. Quelqu’un aurait-il une idée de ce qui peut bien se passer ???
    Merci d’avance

    -----


  2. #2
    I0S_6

    Re : PCR problème de poids moléculaire

    Salut,

    P'tet quelques idées... Pas sur de leur valeur, mais bon

    Tes primers ont peut-être une autre séquence complémentaire quelque part sur le plasmide ?...
    Mauvais marqueur de taille ?
    Problème avec l'agarose ?
    Problème avec le système de migration ?
    Peut-être que ton morceau est complémentaire avec autre chose et qu'il s'y attache et forme ainsi un fragment plus long.. ?
    Si le séquençage est bon.. Je me demande si il n'y a pas une séquence que tes primers aiment bien ailleurs...

    Bref, ce ne sont que quelques idées jetées sur papier.. !

  3. #3
    Zellus

    Re : PCR problème de poids moléculaire

    Bonjour,

    Citation Envoyé par Eno34
    j’ai fini par envoyer à séquencer et pas de problème la séquence voulue est bien là
    Si j'ai bien compris tu as fait séquencer ton ADN qui migre à 3500 pb, et tu as ainsi eu la confirmation que ça correspond bien à ta séquence de 2300 pb, c'est ça ?
    Il n'y a pas de problème alors si ? Tu dois pouvoir continuer tes manips si c'est la bonne séquence (et ce n'était peut-être pas la peine d'acheter d'autres amorces du coup).
    Pour ce qui est de la migration, ton fragment forme peut-être des structures (secondaires, tertiaires ...) particulières qui perturbent son déplacement dans le gel. Tu devrais essayer de le faire migrer dans un gel dénaturant pour voir si tu obtiens la taille attendue.

  4. #4
    Eno34

    Re : PCR problème de poids moléculaire

    Bonjour,
    alors ce ne sont pas des problèmes de migration ou d'agarose j'ai vérifié... J'ai pensé à la complémentarité mais quand je séquence le plasmide de départ avec les primers utilisés pour ma PCR je retrouve la séquence attendue, ce qui veut dire qu'ils s'hybrident au bon endroit...
    Par contre je me suis mal expliquée, j'ai fais séquencer mon plasmide de départ car vu qu'on me l'avait donné j'avais des doutes, mais c'est une bonne idée, je vais récupérer cette bande et la faire séquencer pour voir.
    Merci pour votre aide et je vous tiens au jus de la suite...

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