Bonjour,
Alors voilà j’ai reçu un plasmide d’un collaborateur contenant une séquence qui m’intéresse. Je dois récupérer cette séquence pour la sous-cloner dans un autre vecteur. J’ai donc designé 2 primers contenant le début ou la fin de ma séquence + un site de restriction enzymatique. Le problème est qu’après PCR j’obtiens un fragment à environ 3500pb au lieu des 2300 attendues. Après avoir essayé différentes températures d’hybridation, différentes TAQ… j’ai fini par envoyer à séquencer et pas de problème la séquence voulue est bien là… donc j’ai designé de nouveaux primers car les premiers avaient un Tm très différent, et après PCR je retombe encore sur cette bande trop haute + une bande vers 750, comme avec les précédents primers. J’ai fini par récupérer cette bande pour voir ce que ça donnait après digestion par les 2 enzymes présentes dans mes primers et je récupère encore cette bande à 3500. Quelqu’un aurait-il une idée de ce qui peut bien se passer ???
Merci d’avance
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Envoyé par Eno34