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Extraction ARN total sur fourmi unique



  1. #1
    Plouti

    Extraction ARN total sur fourmi unique

    Bonjour à tous,
    je cherche à extraire l'ARN total à partir d'une fourmi unique, dont je dois tirer 4-5 µg. J'utilise la méthode Trizol-chloroforme, mais j'ai toujours un problème de pureté, spécifique à la fourmi. J'ai un pic d'absorbance à 220-230 nm, dont je n'arrive pas à me débarrasser. De plus, le culot d'ARN est d'une couleur marron très foncé. J'ai essayé de purifié avec une colonne de kit, mais le problème ne s'améliore pas, alors que ça marche sur d'autres organismes. Je suppose que mon problème provient de la cuticule de la fourmi (je filtre mes échantillons sur colonne Qiashredder pour éliminer les gros débris avant la séparation de phase), et j'aimerais savoir si vous aviez des idées pour améliorer mon protocole.
    Merci !

    -----


  2. #2
    Flyingbike

    Re : Extraction ARN total sur fourmi unique

    c'est assez spécifique comme problème !

    On ne peut pas envisager un traitement enzymatique à la protéinase K par exemple ?

    Comment la fourmi est-elle homogénéisée ?

  3. #3
    Plouti

    Re : Extraction ARN total sur fourmi unique

    Et oui, assez spécifique effectivement !
    Un traitement à la protéinase K est-il utile sachant que mon ratio 260/280 est bon ?
    Je broie mes fourmis dans l'azote liquide au mortier-pilon, puis j'homogénéise à la pipette dans le Trizol + un passage sur colonne Qiashredder.
    J'ai lu qu'une précipitation au Chlorure de Lithium (LiCl) permettait d'éliminer certains contaminants, l'un d'entre vous aurait-il un retour d'expérience sur cette méthode ? Ce sera en tout cas ma prochaine étape...

  4. #4
    Flyingbike

    Re : Extraction ARN total sur fourmi unique

    je ne sais pas, je parlais de protéinase K pour mieux dissocier la structure de la bestiole. Que tu aies ou non de la contamination protéique, ca peut éviter d'entrainer des "saloperies".

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