Intéraction protéines p27/p38 ? Western blot

[invitec0a626b7]

Bonjour, j'aurais besoin d'un coup de main sur un exo de biologie cellullaire concernant l'interaction potentielle entre deux protéines inhibitrices des kinases cycline-dépendantes du cycle cellulaire.

On réalise dans un premier temps on réalise un western blot à partir d'une lignée cellulaire A, avec d'un côté, les cellules traitées avec un agent pharmacologique Z et de l'autre non. (Agent Z = induit la production de p38).
On obtient présence de p27 et absence de p38 sans agent Z, et l'inverse avec agent Z.

Ou la protéine p38 a clairement un effet sur la p27 ou l'agent Z produit de la p38 et "détruit" la p27 (c'est ce que je déduis pour l'instant )

On fait donc une deuxième expérience :

On réalise la même expérience en incubant les mêmes cellules dans un inhibiteur du protéasome (LLnL) et de l'autre côté la même chose que l'expérience 1.
(Ici la présence/absence de p38 n'est pas montrée sur le WB)
On on obtient présence de p27 sur Agent Z+LLnL, LLnL sans agent Z et sans agent Z ni LLnL.
On obtient absence de p27 sur Agent Z sans LLnL.

Déjà je vois pas trop à quoi sert le LLnL à part empêcher la dégradation des protéines par le protéasome si je ne me trompe pas.
Donc, là je commence à être pommé ^^.
En fait ce qui change concrétement c'est la présence de p27 en rajoutant le LLnL

=> la p38 dégraderait la p27 ?

Troisième expérience, et là, c'est le drame xD :

On fait in Vivo une IP avec des AC contre p38 suivie d'un SDS Page avec des AC contre p27 et contre p38. Puis WB. Tout ça après avoir cultivé les cellules A en présence et absence de Z et en présence (les deux) de LLnL.
On obtient la même chose qu'à la deuxième expérience SAUF, qu'il n'y pas d'AC p27 en absence d'agent Z (voir expérience 2).

On a en plus, un WB des lysats cellulaires : présence de lysat avec AC p27 en absence et présence de Z et présence d'AC p38 seulement en présence de Z

Je comprends pas pourquoi on trouve des p27 avec le lysat et pas dans les échantillons de l'IP.

Je pense aussi que la p38 régule le taux de p27 par le biais de protéasomes.

S'il vous plaît J'ai les exams qui arrivent et avoir raison me donnerait confiance, et avoir tort me donnerait raison
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[invitec0a626b7]

Décidément, personne veut me répondre sur Futura... ouin....

[invite513ac0a6]

Bon je m'emmerde un peu ajd donc je vais essayer de t'aider. C'est un peu galère sans les blots/figures sous les yeux donc je risque également de me tromper.

1- En admettant selon l'énoncé que l'agent Z induit uniquement la production de p38 (c'est bien plus simple ainsi): ta conclusion est bonne, cela suggère que p38 induit -directement ou indirectement- la dégradation de p27. (pas de p38>p27 présente; induction de p38: plus de p27)

2-Agent Z sans LnLL: même condition que expérience 1, induit la dégradation de p27, jusque là tout va bien.
Agent Z+LnLL: p27 n'est plus dégradée. Cela suggère que la dégradation de p27 induite par p38 dépend du protéasome.

3- l'IP sert à évaluer une interaction entre p38 et p27. Donc quand tu va faire ton WB sur ce que tu as sorti de ton IP, tu vas uniquement pouvoir voir les protéines qui interagissent avec p38 (donc qui co-immunoprécipitent avec p38).
Du coup, en l'absence d'agent Z: pas de p38, donc tu IP rien du tout, donc tu vois pas de p27 alors que p27 est là si tu considères l'intégralité du lysat cellulaire (cf question 1)
En présence d'agent Z: p38 est induite, tu IP p38, et tu trouves un marquage p27 dans les WB que tu fais avec le produit d'IP (si j'ai bien compris, ce que tu dis est pas super clair): cela indique que p27 interagit avec p38.

En conclusion, de ces quelques expériences tu peux conclure que p38 interagit avec p27 et induit sa dégradation de manière dépendante du protéasome, ta conclusion était globalement pas trop mal

[invitec0a626b7]

Merci de clarifier tout ça j'étais pas sûr de mon coup là
(Je me suis un peu facepalmé pour le coup de l'IP de p38 sans trouver de p27 ^^)

Lol, si tu t'emm.... j'ai une une question si tu veux : c'est quoi le lien entre la Claudine 1 et 2 et la cadhérine et caténine dans les jonctions serrées ? ;D

Il me semble que la béta-caténine régule le taux de caténine mais jveux pas dire de onneries.

[A voir en vidéo sur Futura]