Mutation ponctuelle spontanée d'un insert dans un plasmide?

[invite76869701]

Bonjour a toutes et a tous,

Nouveau venu sur ce site, mais avec un peu plus d’expérience en ce qui concerne la biologie, je viens a vous avec une question de débutant... qui me déboussole un peu:

est-il arrivé a quelqu'un de se retrouver avec une mutation spontanée (un C au lieu d'un T) dans un insert cloné dans un plasmide d'expression Eukariote et amplifié dans JM109???

Mon insert n'est plus wt et le collegue qui me l'a passé m'assure que l'insert avait été séquencé. Je ne sais pas quand s'est fait le dernier séquençage... mon opinion a moi c'est que cet insert a été amplifié avec la Taq (il mesure 1200 pb) et cloné a l'ancienne dans le plasmide que je manipule... mais peut etre me trompe-je et des mutations spontanées ne sont pas aussi rares que ça... une opinion tout le monde???

Merci d'avance pour vos commentaires et a bientot...passez de bonnes fetes... JPG
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[Hellbly]

Il est tout à fait probable (et je dirai même que c'est certainement à ce niveau là) que lors de l'amplification de l'insert par la PCR, il y ait eu la mutation.
Pour ma part, j'utilise la polymérase Phusion avec le protocole ad hoc (notamment seulement 25cycles...) pour limiter le risque de mutation lorsque j'amplifie un fragment en vue d'un clonage.
Bref...c'est certes problématique mais pas incroyable.

[invite76869701]

Merci Hellbly pour votre réponse rapide... vous pensez donc comme moi que si mutation il y a c'est au moment d'une amplificaction en PCR et qu'il est tres improbable qu'un plasmide mute du fait de la machinerie enzymatique de la bactérie n'est-ce pas?

[Hellbly]

Il est plus facile de dire qu'une mutation ponctuelle a beaucoup plus de chance de se produire au cours d'une PCR que lors de l'amplification via les bactéries.
Les deux sont possibles bien sûr...mais la probabilité d’occurrence de la mutation est je pense bien différente entre ces deux cas (bien que je n'ai pas de chiffres sous la main...je pense qu'il est possible d'estimer ces probabilités.).
En fait, mon chef passe son temps à me dire qu'une PCR pour un clonage, c'est souvent introduire risque (certes nécessaire) assez élevé de ne pas obtenir la construction voulue.
D'où l'intérêt de séquencer ses plasmides, surtout si jamais tu passes par une PCR dans ton clonage.

[A voir en vidéo sur Futura]