bnj à touts le monde
s'il vous plait qlq qui peut m'aider avec une explication précise de cette question
dans les vecteur de plasmide en peut cloner un ADN étrange par insertion dans un gène de résistance à un antibiotique la question est quelle est la méthode pour identifier les bactéries qui ont incorporés les plasmides recombinés ou le plasmides intacte?
merci d'avance
Bonjour,
Pour identifier les bactéries qui ont incorporées les plasmides recombinant ou les plasmides non-recombinants, il faut étaler, sur une boite de
pétrie, le milieu de culture et l'antibiotique (très souvent de l'ampiciline). On obtiendra donc des colonies à certains endroit ce qui signifie qu'il y a une résistance à l'antibiotique maintenant, ce qui correspond au plasmides recombinants. En revanche, quand il n'y a pas de croissance, cela signifie qu'il s'agit de plasmides non-recombinant.
Bonjour,
Je passe juste pour compléter ce qu'a dit caro56, si tu fais ça tu sélectionne bien les bactérie qui ont intégré le plasmide recombinant mais le problème c'est que dans ce plasmide tu ne sais pas si ton gène a été correctement intégré. Car en fait tu peux avoir des bactéries avec un plasmide recombinant sans ton insert. Dans ce cas pour différencier ces bactéries de celles qui ont le plasmide recombinant avec ton insert, on fait ce que l'on appelle le test blanc-bleu. Dans ton plasmide tu as un gène de résistance, un gène lacz avec son promoteur et d'autre partie encore. Quand tu insères ton ADN tu vas l'inséré au milieu du gène lacZ sous la dépendance de son promoteur. De ce fait en rajoutant du X-gal dans ton milieu (contenant un antibiotique correspondant au gène de résistance) au moment de l'ensemence tu obtiendra 2 types de colonies:
- des colonies bleues ce qui signifie que tu as des bactéries qui ont intégré le plasmide mais pas l'insert puis que celle-ci a pu synthétiser de la B-galactosidase
- des colonies blanches ce qui signifie que tu as des bactéries qui ont intégré le plasmide et l'insert puisque l'insert se retrouve en plein milieu du gène lacZ, il est non fonctionnel donc pas de synthèse de B galactosidase et donc pas d'interaction avec le substrat chromogène (X-gal).
- les colonies qui n'ont pas intégré le plasmide sont éliminées par l'antibiotique contenu dans le milieu car elle n'ont pas le gène de résistance.
J'espère que ça t'aideras. DSL pour les fautes d'ortho je suis un peu pressée ^^
Bonne soirée
Le test LacZ n'est qu'une méthode parmi d'autres pour savoir si le plasmide contient l'insert. Il faut garder l'esprit ouvert par rapport à cela car en laboratoire on n'insère pas systématiquement au milieu d'un site LacZ.
